Konfokalmikroskopi för att mäta tre lägen för fusionspordynamik i binjurekromaffinceller
Summary
Detta protokoll beskriver en konfokal avbildningsteknik för att detektera tre fusionslägen i bovina binjurekromaffinceller. Dessa fusionslägen inkluderar 1) nära fusion (även kallad kiss-and-run), som involverar fusionsporöppning och stängning, 2) stay-fusion, som involverar fusionsporöppning och underhåll av den öppnade poren, och 3) krympfusion, som involverar smält vesikelkrympning.
Abstract
Dynamisk fusionsporöppning och stängning förmedlar exocytos och endocytos och bestämmer deras kinetik. Här demonstreras det i detalj hur konfokalmikroskopi användes i kombination med patch-clamp-inspelning för att detektera tre fusionslägen i primärkulturen bovina binjurekromaffinceller. De tre fusionslägena inkluderar 1) nära fusion (även kallad kiss-and-run), som involverar fusionsporöppning och stängning, 2) stay-fusion, som involverar fusionsporöppning och underhåll av den öppnade poren, och 3) krympfusion, vilket involverar krympning av den fusionsgenererade Ω-formprofilen tills den smälter samman helt vid plasmamembranet.
För att detektera dessa fusionslägen märktes plasmamembranet genom att överuttrycka mNeonGreen fäst med PH-domänen för fosfolipas C δ (PH-mNG), som binder till fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PtdIns(4,5)P2) vid plasmamembranets cytosolvända bipacksedel; vesiklar laddades med den fluorescerande falska neurotransmittorn FFN511 för att detektera frisättning av vesikulärt innehåll; och Atto 655 ingick i badlösningen för att detektera fusionsporförslutning. Dessa tre fluorescerande sonder avbildades samtidigt vid ~ 20-90 ms per bildruta i levande kromaffinceller för att detektera fusionsporöppning, innehållsfrisättning, fusionsporstängning och smältande vesikelstorleksförändringar. Analysmetoden beskrivs för att skilja tre fusionslägen från dessa fluorescensmätningar. Metoden som beskrivs här kan i princip tillämpas på många sekretoriska celler bortom kromaffinceller.
Introduction
Membranfusion förmedlar många biologiska funktioner, inklusive synaptisk överföring, blodsockerhomeostas, immunsvar och viral inträde 1,2,3. Exocytos, som involverar vesikelfusion vid plasmamembranet, frigör neurotransmittorer och hormoner för att uppnå många viktiga funktioner, såsom neuronala nätverksaktiviteter. Fusion öppnar en por för att frigöra vesikulärt innehåll, varefter poren kan stänga för att hämta den smältande vesikeln, som kallas kiss-and-run 1,4. Både irreversibel och reversibel fusionsporöppning kan mätas med cellbundna kapacitansinspelningar i kombination med fusionsporkonduktansinspelningar av enkel vesikelfusion.
Detta tolkas ofta som att det återspeglar fullkollapsfusion, som involverar utvidgning av fusionen tills utplattning av den smältande vesikeln, och kyss-och-kör, som involverar fusionsporöppning respektive stängning 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Nyligen genomförda konfokala och stimulerade emissionsutarmningsstudier (STED) i kromaffinceller observerade direkt fusionsporöppning och stängning (kiss-and-run, även kallad nära fusion), fusionsporöppning som upprätthåller en Ω-form med en öppen por under lång tid, kallad stay-fusion och krympning av den smältande vesikeln tills den är fullständig sammanfogad med plasmamembranet, som ersätter fullkollapsfusion för att smälta samman smältande vesiklar med plasmamembranet4, 8,14,15,16,17.
I nervceller har öppning och stängning av fusionsporer detekterats med avbildning som visar frisättningen av kvantprickar förinstallerade i vesiklar som är större än fusionsporen och med fusionsporkonduktansmätningar vid frisättningsytan på nervterminalerna 5,18,19. Binjurekromaffinceller används ofta som en modell för studier av exo- och endocytos20,21. Även om kromaffinceller innehåller stora tätkärniga vesiklar, medan synapser innehåller små synaptiska vesiklar, är exocytos- och endocytosproteinerna i kromaffinceller och synapser ganska analoga 10,11,12,20,21,22,23.
Här beskrivs en metod för att mäta dessa tre fusionslägen med hjälp av en konfokal avbildningsmetod i kombination med elektrofysiologi i bovina binjurekromaffinceller (figur 1). Denna metod innefattar laddning av fluorescerande falska neurotransmittorer (FFN511) i vesiklar för att detektera exocytos; tillsats av Atto 655 (A655) i badlösningen för att fylla den fusionsgenererade Ω-formprofilen och märkning av plasmamembranet med PH-domänen för fosfoglias C δ (PH), som binder till PtdIns(4,5)P2 vid plasmamembranet 8,15,24. Fusionspordynamik kan detekteras genom förändringar i olika fluorescerande intensiteter. Även om det beskrivs för kromaffinceller kan principen för denna metod som beskrivs här tillämpas i stor utsträckning på många sekretoriska celler långt bortom kromaffinceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
En konfokal mikroskopisk avbildningsmetod beskrivs för att detektera dynamiken i fusionspor- och transmitterfrisättning, samt tre fusionslägen, nära fusion, stay-fusion och krympfusion i bovina binjurekromaffinceller 4,24. En elektrofysiologisk metod för att depolarisera cellen och därigenom framkalla exo- och endocytos beskrivs. Systematisk konfokal bildbehandling ger information om olika lägen för porbeteenden för fusions- och fissionshändelser.
<…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 och ZIA NS003105-08) för att stödja detta arbete.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
Referências
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
