Undersøgelse af scarless vævsregenerering i embryonale sårede kyllingehornhinder
Summary
Den nuværende protokol demonstrerer de forskellige trin, der er involveret i at såre hornhinden hos en embryonal kylling i ovo. De regenererende eller fuldt restaurerede hornhinder kan analyseres for regenerativt potentiale ved hjælp af forskellige cellulære og molekylære teknikker efter sårproceduren.
Abstract
Chick embryonale hornhinde sår viser en bemærkelsesværdig evne til fuldt og hurtigt at regenerere, mens voksne sårede hornhinder oplever et tab af gennemsigtighed på grund af fibrotisk ardannelse. Vævsintegriteten af skadede embryonale hornhinder genoprettes iboende uden påviselig ardannelse. I betragtning af dets tilgængelighed og lette manipulation er kyllingeembryoet en ideel model til at studere reparation af arløse hornhindesår. Denne protokol demonstrerer de forskellige trin, der er involveret i at såre hornhinden af en embryonal kylling i ovo. For det første vinduesæg i tidlige embryonale aldre for at få adgang til øjet. For det andet udføres en række fysiske manipulationer af de ekstraembryoniske membraner for at sikre, at adgangen til øjet opretholdes gennem senere udviklingsstadier, svarende til når hornhindens tre cellulære lag dannes. For det tredje fremstilles lineære hornhindesår, der trænger ind i det ydre epitellag og det forreste stroma, ved hjælp af en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller fuldt restaurerede hornhinder kan analyseres for regenerativt potentiale ved hjælp af forskellige cellulære og molekylære teknikker efter sårproceduren. Undersøgelser til dato ved hjælp af denne model har afsløret, at sårede embryonale hornhinder viser aktivering af keratocytdifferentiering, gennemgår koordineret ombygning af ECM-proteiner til deres oprindelige tredimensionelle makrostruktur og bliver tilstrækkeligt re-innerveret af hornhinde sensoriske nerver. I fremtiden kan den potentielle indvirkning af endogene eller eksogene faktorer på den regenerative proces analyseres i helbredende hornhinder ved hjælp af udviklingsbiologiske teknikker, såsom vævstransplantation, elektroporation, retroviral infektion eller perleimplantation. Den nuværende strategi identificerer den embryonale kylling som et afgørende eksperimentelt paradigme til belysning af de molekylære og cellulære faktorer, der koordinerer arløs heling af hornhindesår.
Introduction
Hornhinden er det gennemsigtige, yderste væv i øjet, der transmitterer og bryder lys, der fremmer synsstyrken. Hos den voksne hornhinde fører beskadigelse eller infektion på hornhindestroma til en hurtig og robust sårhelingsrespons karakteriseret ved keratocytproliferation, fibrose, øget inflammation, der fører til cytokininduceret apoptose, generering af reparationsmyofibroblaster og generel ombygning af den ekstracellulære matrix (ECM)1,2 . Efter skade resulterer sådan reparation af hornhindevæv i uigennemsigtigt arvæv, der reducerer hornhindegennemsigtighed og okkluderer lysets passage og dermed forvrænger synet og i de mest alvorlige tilfælde fører til hornhindeblindhed3. Der er således et klart behov for at udvikle pålidelige dyremodeller for at løse kompleksiteten ved sårheling og identificere de cellulære og molekylære faktorer, der er ansvarlige for sårlukning og vævsregenerering.
Til dato har de fleste undersøgelser, der undersøger heling af hornhindesår, brugt postnatale4 eller voksne dyremodeller 1,2,5,6,7. Mens disse undersøgelser har ført til et betydeligt fremskridt i forståelsen af hornhindesårhelingsresponset og de mekanismer, der ligger til grund for ardannelse, undlader de beskadigede hornhindevæv i disse helbredende modeller fuldt ud at regenerere, hvilket begrænser deres anvendelighed til at identificere de molekylære faktorer og cellulære mekanismer, der er ansvarlige for fuldt ud at rekapitulere hornhindemorfologi og struktur efter skade. I modsætning hertil har fostersår genereret med en kniv i den embryonale kyllingehinden en iboende evne til at helbrede fuldt ud på en arløs måde8. Specifikt udviser den embryonale chick hornhinde nonfibrotisk regenerering med fuldstændig rekapitulering af den ekstracellulære matrixstruktur og innerveringsmønstre 8,9.
Den nuværende protokol beskriver en række trin, der er involveret i at såre hornhinden hos en embryonal kylling i ovo. For det første vindues æg i tidlige embryonale aldre for at lette adgangen til embryoet. For det andet udføres en række fysiske manipulationer af de ekstraembryoniske membraner for at sikre, at adgangen til øjet opretholdes gennem senere udviklingsstadier, svarende til når hornhindens tre cellulære lag dannes, og sår ønskes. For det tredje fremstilles lineære centrale hornhindeindsnit, der trænger gennem hornhindeepitelet og ind i det forreste stroma, ved hjælp af en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller fuldt restaurerede hornhinder kan analyseres for regenerativt potentiale ved hjælp af forskellige cellulære og molekylære teknikker efter sårproceduren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kyllingen er et ideelt modelsystem til undersøgelse af føtal, arløs hornhinde sårreparation. I modsætning til pattedyr er kyllingen let tilgængelig under hele udviklingen ved hjælp af ovo8 eller ex ovo strategier24. Den embryonale kyllingehinden er meget større end gnaverhornhinder, med næsten 50% af kranialvolumenet dedikeret til øjet25, hvilket gør det meget modtageligt for fysiske manipulationer såsom sår. Desuden er…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et kunstnerisk og videnskabeligt udviklingsstipendium gennem Illinois Wesleyan University til TS og finansieret delvist af NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Referências
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Biologia do Desenvolvimento. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
