Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns
Summary
Het huidige protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. De regenererende of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.
Abstract
Kuiken embryonale hoornvlieswonden vertonen een opmerkelijk vermogen om volledig en snel te regenereren, terwijl volwassen gewonde hoornvliezen een verlies van transparantie ervaren als gevolg van fibrotische littekens. De weefselintegriteit van gewonde embryonale hoornvliezen is intrinsiek hersteld zonder detecteerbare littekenvorming. Gezien de toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, is het kuikenembryo een ideaal model voor het bestuderen van littekenloos hoornvlieswondherstel. Dit protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om toegang te krijgen tot het oog. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties naar de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd. Ten derde worden lineaire hoornvlieswonden die de buitenste epitheellaag en het voorste stroma binnendringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure. Studies tot nu toe met behulp van dit model hebben aangetoond dat gewonde embryonale hoornvliezen activering van keratocytendifferentiatie vertonen, gecoördineerde remodellering van ECM-eiwitten ondergaan naar hun oorspronkelijke driedimensionale macrostructuur en adequaat opnieuw worden geïnnerveerd door cornea-sensorische zenuwen. In de toekomst kan de potentiële impact van endogene of exogene factoren op het regeneratieve proces worden geanalyseerd bij het genezen van hoornvliezen met behulp van ontwikkelingsbiologische technieken, zoals weefseltransplantatie, elektroporatie, retrovirale infectie of kraalimplantatie. De huidige strategie identificeert het embryonale kuiken als een cruciaal experimenteel paradigma voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire factoren die de genezing van littekenloze hoornvlieswonden coördineren.
Introduction
Het hoornvlies is het transparante, buitenste weefsel van het oog dat licht doorgeeft en breekt dat bevorderlijk is voor de gezichtsscherpte. In het volwassen hoornvlies leidt schade of infectie aan het corneastroma tot een snelle en robuuste wondgenezingsreactie die wordt gekenmerkt door keratocytenproliferatie, fibrose, verhoogde ontsteking die leidt tot cytokine-geïnduceerde apoptose, generatie van reparatiemyofibroblasten en algehele remodellering van de extracellulaire matrix (ECM)1,2 . Na letsel resulteert een dergelijk herstel van hoornvliesweefsel in ondoorzichtig littekenweefsel dat de transparantie van het hoornvlies vermindert en de doorgang van licht afsluit, waardoor het gezichtsvermogen wordt vervormd en, in de meest ernstige gevallen, leidt tot hoornvliesblindheid3. Er is dus een duidelijke behoefte om betrouwbare diermodellen te ontwikkelen om de complexiteit van wondgenezing aan te pakken en om de cellulaire en moleculaire factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor wondsluiting en weefselregeneratie.
Tot op heden hebben de meeste onderzoeken naar de genezing van hoornvlieswonden postnatale4– of volwassen diermodellengebruikt 1,2,5,6,7. Hoewel deze studies hebben geleid tot een aanzienlijke vooruitgang in het begrip van de cornea wondgenezingsrespons en de mechanismen die ten grondslag liggen aan littekenvorming, slagen de beschadigde corneaweefsels in deze genezingsmodellen er niet in om volledig te regenereren, waardoor hun nut voor het identificeren van de moleculaire factoren en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het volledig recapituleren van corneamorfologie en structuur na letsel wordt beperkt. Foetale wonden die met een mes in het embryonale hoornvlies van het kuiken worden gegenereerd, bezitten daarentegen een intrinsiek vermogen om volledig te genezen op een littekenloze manier8. In het bijzonder vertoont het embryonale hoornvlies van het kuiken nonfibrotische regeneratie met de volledige recapitulatie van de extracellulaire matrixstructuur en innervatiepatronen 8,9.
Het huidige protocol beschrijft een opeenvolging van stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om de toegang tot het embryo te vergemakkelijken. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties van de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd en verwonding gewenst is. Ten derde worden lineaire centrale hoornvliesincisies die door het cornea-epitheel en in het voorste stroma doordringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het kuiken is een ideaal modelsysteem voor het bestuderen van foetaal, littekenloos hoornvlieswondherstel. In tegenstelling tot zoogdieren is het kuiken gemakkelijk toegankelijk tijdens de ontwikkeling met behulp van ovo8 of ex ovo strategieën24. Het embryonale hoornvlies van het kuiken is veel groter dan hoornvliezen van knaagdieren, met bijna 50% van het schedelvolume gewijd aan het oog25, waardoor het zeer vatbaar is voor fysiek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een artistieke en wetenschappelijke ontwikkelingsbeurs via Illinois Wesleyan University aan TS en gedeeltelijk gefinancierd door NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Referências
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Biologia do Desenvolvimento. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
