भ्रूण घायल लड़की कॉर्निया में निशान रहित ऊतक पुनर्जनन की जांच
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल ओवो में एक भ्रूण चूजे के कॉर्निया को घायल करने में शामिल विभिन्न चरणों को दर्शाता है। पुनर्जन्म या पूरी तरह से बहाल कॉर्निया का विश्लेषण घाव प्रक्रिया के बाद विभिन्न सेलुलर और आणविक तकनीकों का उपयोग करके पुनर्योजी क्षमता के लिए किया जा सकता है।
Abstract
चिक भ्रूण कॉर्नियल घाव पूरी तरह से और तेजी से पुनर्जीवित करने की उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जबकि वयस्क घायल कॉर्निया फाइब्रोटिक निशान के कारण पारदर्शिता के नुकसान का अनुभव करते हैं। घायल भ्रूण कॉर्निया की ऊतक अखंडता आंतरिक रूप से कोई पता लगाने योग्य निशान गठन के साथ बहाल की जाती है। इसकी पहुंच और हेरफेर में आसानी को देखते हुए, लड़की भ्रूण स्कारलेस कॉर्नियल घाव की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। यह प्रोटोकॉल ओवो में एक भ्रूण लड़की के कॉर्निया को घायल करने में शामिल विभिन्न चरणों को दर्शाता है। सबसे पहले, आंखों तक पहुंचने के लिए शुरुआती भ्रूण उम्र में अंडे को खिड़की दी जाती है। दूसरा, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली के लिए ओवो शारीरिक जोड़तोड़ की एक श्रृंखला आयोजित की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आंख तक पहुंच विकास के बाद के चरणों के माध्यम से बनाए रखी जाती है, जब कॉर्निया की तीन सेलुलर परतें बनती हैं। तीसरा, रैखिक कॉर्निया घाव जो बाहरी उपकला परत और पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करते हैं, एक माइक्रोसर्जिकल चाकू का उपयोग करके बनाए जाते हैं। पुनर्जनन प्रक्रिया या पूरी तरह से बहाल कॉर्निया का विश्लेषण घाव प्रक्रिया के बाद विभिन्न सेलुलर और आणविक तकनीकों का उपयोग करके पुनर्योजी क्षमता के लिए किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग करके आज तक के अध्ययनों से पता चला है कि घायल भ्रूण कॉर्निया केराटोसाइट भेदभाव की सक्रियता प्रदर्शित करते हैं, अपने मूल त्रि-आयामी मैक्रोस्ट्रक्चर में ईसीएम प्रोटीन के समन्वित रीमॉडेलिंग से गुजरते हैं, और कॉर्नियल संवेदी तंत्रिकाओं द्वारा पर्याप्त रूप से पुन: आंतरिक हो जाते हैं। भविष्य में, पुनर्योजी प्रक्रिया पर अंतर्जात या बहिर्जात कारकों के संभावित प्रभाव का विश्लेषण ऊतक ग्राफ्टिंग, इलेक्ट्रोपोरेशन, रेट्रोवायरल संक्रमण या मनका प्रत्यारोपण जैसी विकासात्मक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करके कॉर्निया को ठीक करने में किया जा सकता है। वर्तमान रणनीति भ्रूण की लड़की को स्कारलेस कॉर्नियल घाव भरने के समन्वय के आणविक और सेलुलर कारकों को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक प्रतिमान के रूप में पहचानती है।
Introduction
कॉर्निया आंख का पारदर्शी, बाहरी ऊतक है जो दृश्य तीक्ष्णता के लिए अनुकूल प्रकाश को प्रसारित और अपवर्तित करता है। वयस्क कॉर्निया में, कॉर्नियल स्ट्रोमा को नुकसान या संक्रमण केराटोसाइट प्रसार, फाइब्रोसिस, साइटोकिन-प्रेरित एपोप्टोसिस के लिए अग्रणी सूजन में वृद्धि, मरम्मत मायोफिब्रोब्लास्ट की पीढ़ी, और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 1,2 के समग्र रीमॉडेलिंग की विशेषता एक तेजी से और मजबूत घाव भरने की प्रतिक्रिया की ओर जाता है . चोट लगने के बाद, इस तरह के कॉर्नियल ऊतक की मरम्मत के परिणामस्वरूप अपारदर्शी निशान ऊतक होता है जो कॉर्नियल पारदर्शिता को कम करता है और प्रकाश के पारित होने को रोकता है, इस प्रकार दृष्टि को विकृत करता है और सबसे गंभीर मामलों में, कॉर्नियल अंधापन3. इस प्रकार, घाव भरने की जटिलताओं को संबोधित करने और घाव बंद करने और ऊतक पुनर्जनन के लिए जिम्मेदार सेलुलर और आणविक कारकों की पहचान करने के लिए विश्वसनीय पशु मॉडल विकसित करने की स्पष्ट आवश्यकता है।
आज तक, कॉर्नियल घाव भरने की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययनों ने प्रसवोत्तर4 या वयस्क पशु मॉडल 1,2,5,6,7 का उपयोग किया है। जबकि इन अध्ययनों ने कॉर्नियल घाव भरने की प्रतिक्रिया और निशान गठन अंतर्निहित तंत्र की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति की है, इन उपचार मॉडलों में क्षतिग्रस्त कॉर्नियल ऊतक पूरी तरह से पुनर्जीवित करने में विफल रहते हैं, इस प्रकार कॉर्नियल आकृति विज्ञान और संरचना को पूरी तरह से पुनरावृत्ति के लिए जिम्मेदार आणविक कारकों और सेलुलर तंत्र की पहचान करने के लिए उनकी उपयोगिता को सीमित करते हैं। इसके विपरीत, भ्रूण चिक कॉर्निया में चाकू से उत्पन्न भ्रूण के घावों में एक स्कारलेस फैशन में पूरी तरह से ठीक होने की आंतरिक क्षमता होतीहै 8. विशेष रूप से, भ्रूण चिक कॉर्निया बाह्य मैट्रिक्स संरचना और इनर्वेशन पैटर्न 8,9 के पूर्ण पुनरावृत्ति के साथ नॉनफाइब्रोटिक पुनर्जनन प्रदर्शित करता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल ओवो में एक भ्रूण लड़की के कॉर्निया को घायल करने में शामिल चरणों के अनुक्रम का वर्णन करता है। सबसे पहले, भ्रूण तक पहुंच की सुविधा के लिए शुरुआती भ्रूण उम्र में अंडे को खिड़की दी जाती है। दूसरा, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली के लिए ओवो शारीरिक जोड़तोड़ की एक श्रृंखला आयोजित की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आंख तक पहुंच विकास के बाद के चरणों के माध्यम से बनाए रखी जाती है, जब कॉर्निया की तीन सेलुलर परतें बनती हैं और घायल होना वांछित होता है। तीसरा, कॉर्नियल उपकला के माध्यम से और पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करने वाले रैखिक केंद्रीय कॉर्निया चीरों को माइक्रोसर्जिकल चाकू का उपयोग करके बनाया जाता है। पुनर्जनन प्रक्रिया या पूरी तरह से बहाल कॉर्निया का विश्लेषण घाव प्रक्रिया के बाद विभिन्न सेलुलर और आणविक तकनीकों का उपयोग करके पुनर्योजी क्षमता के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूजा भ्रूण, स्कारलेस कॉर्निया घाव की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है। स्तनधारियों के विपरीत, ओवो8 या पूर्व ओवो रणनीतियों24 में उपयोग करके चूजा पूरे विकास म?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को इलिनोइस वेस्लेयन विश्वविद्यालय के माध्यम से टीएस के लिए एक कलात्मक और विद्वानों के विकास अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और एनआईएच-आर 01 ईवाई 022158 (पीएल) द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Referências
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