Undersøkelse av arrfri vevregenerering i embryonale sårede kyllinghornhinner
Summary
Den nåværende protokollen demonstrerer de forskjellige trinnene som er involvert i å skade hornhinnen til en embryonal kylling i ovo. De regenererende eller fullt restaurerte hornhinnene kan analyseres for regenerativt potensial ved hjelp av ulike cellulære og molekylære teknikker etter sårprosedyren.
Abstract
Chick embryonale hornhinne sår viser en bemerkelsesverdig kapasitet til å fullstendig og raskt regenerere, mens voksne sårede hornhinner opplever tap av gjennomsiktighet på grunn av fibrotisk arrdannelse. Vevsintegriteten til skadede embryonale hornhinner er iboende gjenopprettet uten påvisbar arrdannelse. Gitt sin tilgjengelighet og enkle manipulasjon, er kyllingembryoet en ideell modell for å studere arrfri hornhinnesårreparasjon. Denne protokollen demonstrerer de forskjellige trinnene som er involvert i å skade hornhinnen til en embryonal kylling i ovo. Først blir egg windowed på tidlig embryonale aldre for å få tilgang til øyet. For det andre utføres en serie in ovo fysiske manipulasjoner til de ekstraembryoniske membranene for å sikre at tilgangen til øyet opprettholdes gjennom senere utviklingsstadier, tilsvarende når de tre cellulære lagene i hornhinnen dannes. For det tredje er lineære hornhinnesår som trenger inn i det ytre epitellaget og det fremre stroma laget ved hjelp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprosessen eller fullt restaurerte hornhinner kan analyseres for regenerativt potensial ved hjelp av ulike cellulære og molekylære teknikker etter sårprosedyren. Studier til dags dato ved hjelp av denne modellen har vist at sårede embryonale hornhinner viser aktivering av keratocytdifferensiering, gjennomgår koordinert ombygging av ECM-proteiner til deres opprinnelige tredimensjonale makrostruktur, og blir tilstrekkelig re-innervert av hornhinde sensoriske nerver. I fremtiden kan den potensielle effekten av endogene eller eksogene faktorer på den regenerative prosessen analyseres i helbredende hornhinner ved hjelp av utviklingsbiologiske teknikker, for eksempel vevtransplantasjon, elektroporering, retroviral infeksjon eller perleimplantasjon. Den nåværende strategien identifiserer den embryonale kyllingen som et avgjørende eksperimentelt paradigme for å belyse de molekylære og cellulære faktorene som koordinerer arrfri hornhinnenes sårheling.
Introduction
Hornhinnen er det gjennomsiktige, ytre vevet i øyet som overfører og bryter lys som bidrar til synsskarphet. I den voksne hornhinnen fører skade eller infeksjon på hornhinnen til en rask og robust sårhelingsrespons karakterisert ved keratocyttproliferasjon, fibrose, økt betennelse som fører til cytokinindusert apoptose, generering av reparasjonsmyofibroblaster og generell ombygging av den ekstracellulære matriksen (ECM)1,2 . Etter skade resulterer slik reparasjon av hornhinnevev i ugjennomsiktig arrvev som reduserer hornhinnens gjennomsiktighet og okkluderer lysets passasje, og dermed forvrenger synet og i de alvorligste tilfellene fører til hornhindeblindhet3. Dermed er det et klart behov for å utvikle pålitelige dyremodeller for å takle kompleksiteten i sårheling og å identifisere de cellulære og molekylære faktorene som er ansvarlige for sårlukking og vevregenerering.
Til dags dato har de fleste studier som undersøker hornhinnenes sårheling benyttet postnatal4 eller voksne dyremodeller 1,2,5,6,7. Selv om disse studiene har ført til en betydelig fremgang i forståelsen av hornhinnenes sårhelingsrespons og mekanismene som ligger til grunn for arrdannelse, klarer ikke det skadede hornhinnevevet i disse helbredende modellene å regenerere fullt ut, og begrenser dermed deres nytte for å identifisere molekylære faktorer og cellulære mekanismer som er ansvarlige for fullstendig rekapitulering av hornhindemorfologi og struktur etter skade. Derimot har fostersår generert med en kniv i den embryonale kyllinghornhinnen en egen evne til å helbrede fullt ut på en arrfri måte8. Spesielt utviser den embryonale kyllinghornhinnen nonfibrotisk regenerering med fullstendig rekapitulering av den ekstracellulære matriksstrukturen og innerveringsmønstrene 8,9.
Den nåværende protokollen beskriver en sekvens av trinn involvert i å skade hornhinnen til en embryonal kylling i ovo. For det første blir egg vindut i tidlig embryonal alder for å lette tilgangen til embryoet. For det andre utføres en serie in ovo fysiske manipulasjoner til de ekstraembryoniske membranene for å sikre at tilgangen til øyet opprettholdes gjennom senere utviklingsstadier, tilsvarende når de tre cellulære lagene i hornhinnen dannes og sår er ønsket. For det tredje er lineære sentrale hornhinneinnsnitt som trenger gjennom hornhinneepitelet og inn i det fremre stroma laget ved hjelp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprosessen eller fullt restaurerte hornhinner kan analyseres for regenerativt potensial ved hjelp av ulike cellulære og molekylære teknikker etter sårprosedyren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kyllingen er et ideelt modellsystem for å studere foster, arrfri hornhinne sårreparasjon. I motsetning til pattedyr er kyllingen lett tilgjengelig gjennom hele utviklingen ved hjelp av ovo8 eller ex ovo strategier24. Den embryonale kyllinghornhinnen er mye større enn gnagere hornhinner, med nesten 50% av kranialvolumet dedikert til øyet25, noe som gjør det svært mottagelig for fysiske manipulasjoner som sår. Videre er kylling…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et kunstnerisk og vitenskapelig utviklingsstipend gjennom Illinois Wesleyan University til TS og finansiert delvis av NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Referências
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Biologia do Desenvolvimento. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
