Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários
Summary
O presente protocolo demonstra as diferentes etapas envolvidas na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. As córneas regeneradoras ou totalmente restauradas podem ser analisadas para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.
Abstract
As feridas na córneas embrionárias do pintinho apresentam uma capacidade notável de se regenerarem totalmente e rapidamente, enquanto as córneas feridas adultas experimentam uma perda de transparência devido a cicatrizes fibrosas. A integridade tecidual das córneas embrionárias feridas é intrinsecamente restaurada sem formação detectável de cicatrizes. Dada a sua acessibilidade e facilidade de manipulação, o embrião de filhotes é um modelo ideal para estudar o reparo da ferida córnea sem cicatrizes. Este protocolo demonstra os diferentes passos envolvidos na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. Primeiro, os ovos são janelas em idades embrionárias precoces para acessar o olho. Em segundo lugar, uma série de manipulações físicas de ovo para as membranas extraembriônicas são conduzidas para garantir que o acesso ao olho seja mantido através de estágios posteriores de desenvolvimento, correspondendo a quando as três camadas celulares da córnea são formadas. Terceiro, feridas lineares de córnea que penetram na camada epitelial externa e no estroma anterior são feitas usando uma faca microcirúrgica. O processo de regeneração ou córneas totalmente restauradas pode ser analisado para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir. Estudos até o momento usando este modelo revelaram que as córneas embrionárias feridas exibem ativação da diferenciação de ceratocitos, passam por remodelação coordenada de proteínas ECM à sua macroestrutura tridimensional nativa e tornam-se adequadamente re-inervadas por nervos sensoriais córneas. No futuro, o impacto potencial de fatores endógenos ou exógenos no processo regenerativo poderia ser analisado na cura de córneas usando técnicas de biologia do desenvolvimento, como enxerto de tecido, eletroporação, infecção retroviral ou implantação de contas. A estratégia atual identifica o filhote embrionário como um paradigma experimental crucial para elucidar os fatores moleculares e celulares que coordenam a cicatrização da ferida córnea.
Introduction
A córnea é o tecido transparente, mais externo do olho que transmite e refrata a luz propícia à acuidade visual. Na córnea adulta, danos ou infecções no estroma córnea leva a uma resposta rápida e robusta de cicatrização de feridas caracterizada pela proliferação de ceratocitos, fibrose, aumento da inflamação que leva à apoptose induzida por citocina, geração de miofibroblasts de reparação e remodelação geral da matriz extracelular (ECM)1,2 . Após a lesão, tal reparação do tecido córnea resulta em tecido cicatrizado opaco que reduz a transparência da córnea e oclui a passagem da luz, distorcendo assim a visão e, nos casos mais graves, levando à cegueira corneal3. Assim, há uma clara necessidade de desenvolver modelos animais confiáveis para abordar as complexidades da cicatrização das feridas e identificar os fatores celulares e moleculares responsáveis pelo fechamento da ferida e regeneração tecidual.
Até o momento, a maioria dos estudos que examinam a cicatrização de feridas córneas utilizaram modelos de animais pós-natal4 ou adultos 1,2,5,6,7. Embora esses estudos tenham levado a um avanço significativo na compreensão da resposta de cura da ferida córnea e dos mecanismos subjacentes à formação da cicatriz, os tecidos córneas danificados nesses modelos de cura não se regeneram totalmente, limitando assim sua utilidade para identificar os fatores moleculares e mecanismos celulares responsáveis pela recapitulação completa da morfologia cornela e da estrutura pós-lesão. Em contraste, as feridas fetais geradas com uma faca na córnea do pintinho embrionário possuem uma capacidade intrínseca de curar totalmente de forma sem cicatrizes8. Especificamente, a córnea de pintinho embrionário apresenta regeneração não fibritic com a recapitulação completa da estrutura da matriz extracelular e padrões de inervação 8,9.
O presente protocolo descreve uma sequência de passos envolvidos na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. Primeiro, os ovos são janelas em idades embrionárias precoces para facilitar o acesso ao embrião. Em segundo lugar, uma série de manipulações físicas de ovo para as membranas extraembriônicas são conduzidas para garantir que o acesso ao olho seja mantido através de estágios posteriores de desenvolvimento, correspondendo a quando as três camadas celulares da córnea são formadas e o ferimento é desejado. Terceira, incisões lineares de córnea central penetrando através do epitélio córnea e no estroma anterior são feitas usando uma faca microcirúrgica. O processo de regeneração ou córneas totalmente restauradas pode ser analisado para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.
Protocol
Representative Results
Discussion
O filhote é um sistema modelo ideal para estudar o reparo da ferida da córnea fetal e sem cicatrizes. Ao contrário dos mamíferos, o filhote é facilmente acessível durante todo o desenvolvimento usando em estratégias ovo8 ou ex ovo 24. A córnea de pintinho embrionário é muito maior que as córneas de roedores, com quase 50% do volume craniano dedicado ao olho25, tornando-a altamente favorável a manipulações físicas como…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Desenvolvimento Artístico e Acadêmico através da Universidade Wesleyan de Illinois para a TS e financiado em parte pelo NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Referências
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Biologia do Desenvolvimento. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
