Undersöker ärrlös vävnadsregenerering i embryonala sårade kycklingkornor
Summary
Det nuvarande protokollet visar de olika stegen som är involverade i att såra hornhinnan hos en embryonal kyckling i ovo. De regenererande eller helt återställda hornhinnorna kan analyseras för regenerativ potential med hjälp av olika cellulära och molekylära tekniker efter sårproceduren.
Abstract
Chick embryonala hornhinnesår visar en anmärkningsvärd förmåga att helt och snabbt regenerera, medan vuxna sårade hornhinnor upplever en förlust av transparens på grund av fibrotisk ärrbildning. Vävnadsintegriteten hos skadade embryonala hornhinnor återställs i sig utan detekterbar ärrbildning. Med tanke på dess tillgänglighet och lätthet att manipulera är kycklingembryomet en idealisk modell för att studera ärrlös hornhinnesårreparation. Detta protokoll visar de olika stegen som är involverade i att såra hornhinnan hos en embryonal kyckling i ovo. Först fönsteras ägg i tidiga embryonala åldrar för att komma åt ögat. För det andra utförs en serie in ovo fysiska manipuleringar till de extraembryoniska membranen för att säkerställa att tillgången till ögat upprätthålls genom senare utvecklingsstadier, vilket motsvarar när de tre cellulära skikten i hornhinnan bildas. För det tredje tillverkas linjära hornhinnesår som tränger in i det yttre epitelskiktet och den främre stroma med hjälp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller helt återställda hornhinnor kan analyseras för regenerativ potential med hjälp av olika cellulära och molekylära tekniker efter sårproceduren. Studier hittills med hjälp av denna modell har visat att sårade embryonala hornhinnor visar aktivering av keratocytdifferentiering, genomgår samordnad ombyggnad av ECM-proteiner till deras ursprungliga tredimensionella makrostruktur och blir tillräckligt re-innerverade av hornhinnans sensoriska nerver. I framtiden kan den potentiella effekten av endogena eller exogena faktorer på den regenerativa processen analyseras vid läkning av hornhinnor med hjälp av utvecklingsbiologiska tekniker, såsom vävnadstransplantation, elektroporering, retroviral infektion eller pärlimplantation. Den nuvarande strategin identifierar den embryonala kycklingen som ett avgörande experimentellt paradigm för att belysa de molekylära och cellulära faktorer som samordnar ärrlös hornhinnesårläkning.
Introduction
Hornhinnan är den transparenta, yttre vävnaden i ögat som överför och bryter ljus som bidrar till synskärpa. I den vuxna hornhinnan leder skada eller infektion i hornhinnans stroma till ett snabbt och robust sårläkningssvar som kännetecknas av keratocytproliferation, fibros, ökad inflammation som leder till cytokininducerad apoptos, generering av reparationsmyofibroblaster och övergripande ombyggnad av den extracellulära matrisen (ECM)1,2 . Efter skada resulterar sådan reparation av hornhinnan i vävnad i ogenomskinlig ärrvävnad som minskar hornhinnans transparens och täcker ljusets passage, vilket snedvrider synen och i de allvarligaste fallen leder till hornhinneblindhet3. Det finns således ett tydligt behov av att utveckla tillförlitliga djurmodeller för att ta itu med komplexiteten i sårläkning och för att identifiera de cellulära och molekylära faktorer som är ansvariga för sårstängning och vävnadsregenerering.
Hittills har de flesta studier som undersöker hornhinnans sårläkning använt postnatal4 eller vuxna djurmodeller 1,2,5,6,7. Även om dessa studier har lett till en betydande utveckling i förståelsen av hornhinnans sårläkningssvar och mekanismerna bakom ärrbildning, misslyckas de skadade hornhinnevävnaderna i dessa läkningsmodeller att regenerera helt, vilket begränsar deras användbarhet för att identifiera de molekylära faktorer och cellulära mekanismer som är ansvariga för att fullständigt rekapitulera hornhinnans morfologi och struktur efter skada. Däremot har fostersår som genereras med en kniv i den embryonala kycklinghinnan en inneboende förmåga att läka helt på ett ärrlöst sätt8. Specifikt uppvisar den embryonala kycklinghinnan icke-fibrotisk regenerering med fullständig rekapitulation av den extracellulära matrisstrukturen och innervationsmönstren 8,9.
Det nuvarande protokollet beskriver en sekvens av steg som är involverade i att såra hornhinnan hos en embryonal kyckling i ovo. Först fönsteras ägg i tidiga embryonala åldrar för att underlätta tillgången till embryot. För det andra utförs en serie in ovo fysiska manipuleringar till de extraembryoniska membranen för att säkerställa att tillgången till ögat upprätthålls genom senare utvecklingsstadier, vilket motsvarar när de tre cellulära skikten i hornhinnan bildas och sår önskas. För det tredje görs linjära centrala hornhinnesnitt som tränger igenom hornhinneepitelet och in i den främre stroma med hjälp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller helt återställda hornhinnor kan analyseras för regenerativ potential med hjälp av olika cellulära och molekylära tekniker efter sårproceduren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kycklingen är ett idealiskt modellsystem för att studera fostrets, ärrlösa hornhinne sårreparation. Till skillnad från däggdjur är kycklingen lättillgänglig under hela utvecklingen med hjälp av i ovo8 eller ex ovo strategier24. Den embryonala kycklinghinnan är mycket större än gnagare hornhinnor, med nästan 50% av kranialvolymen tillägnad ögat25, vilket gör den mycket mottaglig för fysiska manipulationer som sår….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett konstnärligt och vetenskapligt utvecklingsbidrag genom Illinois Wesleyan University till TS och finansierades delvis av NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Referências
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Biologia do Desenvolvimento. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
