Um método sem chamas para esterilizar C. elegans Picks, Espástulas e Bisturis

Summary

Este artigo descreve um método para esterilizar picaretas, espátulas e bisturis usando um micro-incinerador no lugar de uma chama aberta.

Abstract

Caenorhabtidis elegans (C. elegans) é um organismo modelo ideal para pesquisa e educação em instituições de graduação. Os graduandos podem aprender rapidamente a técnica estéril necessária para manter as culturas C. elegans . A esterilização de picaretas de platina usadas para transferir vermes de uma placa para outra é tradicionalmente feita segurando a picareta em uma chama de um queimador de Bunsen ou lanterna de etanol. No entanto, os queimadores de Bunsen requerem uma fonte de gás, e ambos os equipamentos representam o risco de incêndio acidental associado a uma chama aberta. Demonstrado aqui é uma técnica para esterilizar picaretas de vermes, espátulas e bisturis usando um micro-incinerador de loop bacteriológico infravermelho. Este equipamento requer apenas uma tomada elétrica e minimiza possíveis riscos de incêndio. Ao reduzir os riscos e os requisitos de gás, essa técnica é adequada para pesquisa e ensino em um ambiente de graduação.

Introduction

O organismo modelo C. elegans é adequado tanto para pesquisa quanto para a educação em instituições de graduação (PUIs) devido ao baixo custo, facilidade de manutenção e gama de aplicações 1,2,3,4. A fim de lidar com vermes - por exemplo, para mover um verme de uma placa para outra, os experimentadores podem usar uma picareta de vermes. Uma variedade de picaretas podem ser feitas ou compradas para uso com C. elegans. As picaretas são mais comumente feitas usando uma ponta de platina ou platina/irídio, montada em um copo, metal ou alça de madeira. As alças de vidro podem ser feitas internamente derretendo uma pipeta Pasteur em torno de um fio de platina até que o fio esteja seguro. Informações adicionais sobre a criação de C. elegans, incluindo como cultivar e manter vermes e suas fontes de alimento, podem ser encontradas no WormBook⁵ e outras fontes ^6,7,8.

Ao trabalhar com C. elegans, técnicas assépticas são tipicamente usadas para evitar contaminação com micróbios e fungos. Exemplos de técnicas assépticas incluem esterilização de instrumentos, autoclavagem de reagentes e condução de trabalhos em campos estéreis. As picaretas de vermes são tipicamente esterilizadas usando uma chama aberta⁹. Além disso, a esterilização da picareta de vermes incinera vermes, evitando assim misturas acidentais de cepas ao trabalhar com múltiplas cepas de vermes. Os métodos típicos para esterilizar picaretas de vermes envolvem uma chama aberta de um queimador de Bunsen, lanterna de etanol ou isqueiro padrão (Tabela 1). Fomos motivados a buscar alternativas mais seguras aos métodos existentes em laboratório quando um estudante de graduação, sem saber, derramou etanol enquanto enchia uma lanterna de etanol e acidentalmente iniciou um pequeno incêndio ao acender a lanterna. Infelizmente, muitos acidentes foram relatados usando lanternas de etanol 10,11,12. Felizmente, métodos alternativos de esterilização foram validados para uso em microbiologia, e o objetivo deste artigo é demonstrar como utilizar este equipamento para esterilizar instrumentos para uso com C. elegans.

Nos laboratórios de microbiologia, a técnica asséptica também é crítica. Laços sorológicos e fios feitos de platina são esterilizados usando uma chama aberta¹³ ou um micro-incinerador 14,15,16. Outros nomes para micro-incineradores incluem micro-esterilizadores ou bacto-incineradores. As vantagens do micro-incinerador sobre os métodos tradicionais de chama incluem redução do risco de incêndio, eliminação de respingos de materiais incinerados e capacidade de trabalhar em um armário de capô de fluxo laminar/biossegurança 16,17,18. De fato, tanto a Sociedade Americana de Microbiologia quanto a Organização Mundial da Saúde recomendam o uso de micro-incineradores sobre o uso de uma chama aberta^de 17,19,20. Em comparação com os queimadores de Bunsen, os micro-incineradores também não exigem uma linha de gás, que alguns laboratórios podem não ter, ou podem não ter localizado em cada banco para os alunos usarem. Inspirado nessas vantagens, foi desenvolvido um protocolo para substituir o uso de chama por micro-incineradores para esterilização de instrumentos comumente usados, como picaretas, espátulas e bisturis no laboratório C. elegans. Este método pode ser apropriado para instrutores e pesquisadores que buscam aumentar a segurança e/ou flexibilidade ao trabalhar com C. elegans.

Protocol

1. Prepare o micro-incinerador

1. Conecte um guia de acessório do suporte de loop ao micro-incinerador, cortando-o no barril externo.
2. Conecte o micro-incinerador a uma tomada elétrica padrão de 120 V ou 230 V, conforme apropriado.
   NOTA: Isso pode ser feito em um banco ou em um capô de fluxo laminar.
3. Gire o micro-incinerador para o ajuste alto e deixe-o aquecer por 10-20 min, dependendo das instruções do fabricante para atingir uma temperatura ótima de 800-825 ^oC.
   NOTA: Se manter o incinerador ligado por mais de 3h, a configuração de temperatura mais baixa (500 ^oC) pode ser usada como configuração de espera. De acordo com os manuais de usuário dos fabricantes, isso prolonga a vida útil do equipamento.

2. Esterilize a picareta, espátula ou bisturi

1. Insira o instrumento na área de esterilização cilíndrica sem tocar nas laterais deslizando ao longo do guia²¹.
   NOTA: Se esterilizar um bisturi, é fundamental evitar tocar na parede cerâmica com a lâmina. Raspar a parede cerâmica pode comprometer a integridade da unidade de aquecimento.
2. Segure o instrumento na área de esterilização para 5-7 s.
3. Remova o instrumento sem tocar nas laterais deslizando para trás ao longo do guia.
4. Para as picaretas, deixe o instrumento esfriar por 3-5 s antes de tocar em um verme para evitar queimá-lo.
   NOTA: Bisturis ou espátulas que não podem esfriar cantarão o ágar.
5. Depois de colher vermes, reinsira a picareta na câmara para 5-7 s para incinerar quaisquer vermes na picareta.

3. Método comparativo - esterilização de instrumentos usando um queimador Bunsen

1. Conecte o queimador Bunsen à linha de gás usando tubos de borracha. Certifique-se de fixar a tubulação firmemente e posicionar o queimador longe de objetos aéreos.
2. Ligue o gás girando o botão na linha de gás.
3. Aciime o queimador usando um atacante ou um isqueiro.
4. Ajuste a chama usando o botão de gás e a entrada de ar até que um cone azul seja visível.
5. Segure a picareta, espátula ou bisturi na chama até que ela brilhe vermelha.
6. Para as escolhas, deixe o instrumento esfriar por 3-5 segundos antes de tocar em um verme para evitar queimá-lo.
   NOTA: Bisturis ou espátulas que não podem esfriar cantarão o ágar.
7. Depois de colher vermes, reinsira a picareta na chama para incinerar qualquer verme na picareta.

4. Experimento

1. Cultura OP50 Escherichia coli (E. coli) bactérias em Luria Caldo²² durante a noite em um shaker de 37 ^oC.
2. Após a cultura da noite para o dia, diluir a cultura em água estéril a uma proporção de 1:100.
   NOTA: Este fator de diluição foi escolhido para garantir a separação das colônias após o revestimento.
3. Mergulhe uma picareta de vermes esterilizada usando um queimador Bunsen na solução bacteriana, ressarem com o queimador de Bunsen e gire-o em 100 mL de água estéril.
4. Emplaque os 100 μL de água em uma placa de ágar de 10 cm LB ^22,23, espalhe a água usando um espalhador de células estéreis e incubar à temperatura ambiente por 24 h com a tampa ligada.
5. Execute as etapas 4.3-4.4 usando uma picareta de vermes esterilizada usando um micro-incinerador.
6. Como controle positivo, realize as etapas 4.3-4.4 sem re-esterilização.
7. Como controle negativo, realize as etapas 4.3-4.4 utilizando água estéril no lugar da solução bacteriana.
8. Conte as colônias manualmente após o período de incubação.

Results

Um simples experimento (seção 4) foi concebido para demonstrar as taxas relativas de contaminação usando um micro-incinerador versus uma chama (Figura 1, Tabela 2). Embora esses resultados representem taxas de contaminação entre os métodos, não seria necessário repetir este método para usar a técnica do micro-incinerador. O experimento foi realizado em triplicado. Controle negativo era água estéril sem bactérias. O controle positivo não utilizou nenhuma técnica de esterilização: a picareta foi mergulhada na cultura OP50 diluída e depois transferida diretamente para a água estéril. Todas as réplicas e condições foram executadas em paralelo no mesmo dia. Nas três placas de controle negativas, foram contadas colônias zero. Uma contagem média de 4,7 (± 0,3 SEM) foi obtida quando o queimador de Bunsen foi usado para esterilizar picaretas. Observou-se contagem média de 3,3 (±1,2 SEM) na condição de micro-incinerador. No entanto, obteve-se uma contagem média de 298,3 (±17,9 SEM) na condição positiva de controle. Um teste t de 2 caudas assumindo igual variância comparando o queimador de Bunsen com o micro-incinerador não produziu diferença estatisticamente significativa, p = 0,35. Assim, o micro-incinerador alcançou resultados de esterilidade igualmente eficazes para o queimador Bunsen.

Figura 1: A contagem bacteriana entre os métodos de esterilização. As picaretas foram mergulhadas na cultura OP50 1:100 em água estéril e depois esterilizadas usando um queimador de Bunsen ou micro-incinerador. As picaretas foram então mergulhadas em água estéril, banhadas em^{ágar LB 22,23}, e incubadas por 24 h à temperatura ambiente, e colônias foram contadas manualmente. O controle positivo não tinha esterilização, e o controle negativo usava água estéril sem bactérias. n = 3 réplicas por condição. Nota: o eixo y é quebrado para permitir a separação dos pontos de dados em partes relevantes do gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Método de esterilização	Custar	Requisitos de laboratório	Vantagens		Desvantagens
Micro-incinerador	$365-530	Tomada de 120 V ou 230 V	• Portátil • Sem chama aberta ou elemento de aquecimento exposto • Usável em capô de fluxo laminar e armários de segurança biológica		• Tempo de aquecimento • Custo mais alto
Bico de Bunsen	$24-169	Linha de Gás	• Configuração rápida • Baixo custo		• Chama Aberta • Não recomendado para uso em capô de fluxo laminar ou gabinete de segurança biológica
Lâmpada de Etanol	11 dólares	Nenhum	• Configuração rápida • Baixo custo • Recarregável		• Chama Aberta • Risco de segurança ao reabastecendo • Não recomendado para uso em capô de fluxo laminar ou gabinete de segurança biológica • Não é permitido em determinadas instituições
Isqueiro	$5-8	Nenhum	• Baixo custo • Acessível • Descartável • Recarregável		• Chama Aberta • Operado à mão • Não recomendado para uso em capô de fluxo laminar ou gabinete de segurança biológica

Tabela 1: Comparação de métodos para esterilização de instrumentos. Quatro métodos de esterilização de instrumentos foram comparados com base em vantagens, desvantagens, custos e requisitos laboratoriais.

Replicar	Condição
	Micro-incinerador	Bico de Bunsen	Controle Negativo	Controle de Positve
1	1	5	0	278
2	4	4	0	334
3	5	5	0	283
Significar	3.3	4.7	0.0	298.3
SEM	1.2	0.3	0.0	17.9

Tabela 2: Dados brutos de contagens bacterianas entre métodos de esterilização. As picaretas foram mergulhadas na cultura OP50 1:100 em água estéril e depois esterilizadas usando um queimador de Bunsen ou micro-incinerador. As picaretas foram então mergulhadas em água estéril, banhadas em^{ágar LB 22,23}, e incubadas por 24 h à temperatura ambiente, e colônias foram contadas manualmente. O controle positivo não tinha esterilização, e o controle negativo usava água estéril sem bactérias. n = 3 réplicas por condição. Média e SEM relatadas abaixo das contagens individuais.

Discussion

C. elegans é um organismo modelo bem adequado para exercícios em laboratórios de ensino de graduação. O uso de micro-incineradores no lugar de chamas abertas proporciona benefícios tanto em laboratórios de pesquisa quanto em laboratórios de sala de aula. De fato, cursos de laboratório de graduação podem representar um risco maior de incêndios acidentais, dado o número de cientistas recém-treinados na sala. Além disso, o risco de incêndio aumenta quando o etanol é usado para esterilizar instrumentos próximos à fonte de chama, pois vapores de etanol são inflamáveis. A portabilidade também confere uma vantagem para as salas de aula onde as linhas de gás não são instaladas em cada banco. Esse método tem sido empregado em laboratórios de ensino e pesquisa em nossa instituição, resultando em não aumento de contaminação e zero acidentes de segurança laboratorial desde sua incorporação em 2016.

Para garantir a compatibilidade com micro-incineradores, foram testadas uma série de picaretas com diferentes montagens, composições de fios e medidores de arame. A composição do fio incluiu 100% de platina, bem como 90% de platina/10% de irídio com espessura de fio de 30-32 G, e independentemente da espessura e composição, o método de aquecimento não comprometeu a integridade do fio. As montagens incluíram dois tipos diferentes de alças de picaretas disponíveis comercialmente e montagens de vidro feitas em casa de pipetas Pasteur. Note que as picaretas não brilham em vermelho-quente como fazem na chama. No entanto, a esterilização suficiente ainda é alcançada desde que o esterilizador tenha atingido a temperatura adequada. Assim, é fundamental permitir que o microcinerador aqueça por 10 ou 20 min, conforme indicado nas instruções do fabricante. Manter o instrumento na câmara por pelo menos 5 s para alcançar a esterilização também é fundamental. Deixar o instrumento na câmara com mais de 7 s não causará danos ao instrumento, mas é desnecessário. Embora este seja um procedimento relativamente simples com passos mínimos e é improvável que precise de solução de problemas, pode ser preciso alguma prática para aprender a estabilizar o instrumento no barril sem tocar nas laterais.

Para substituir uma chama aberta, um método de esterilização deve cobrir todas as aplicações utilizadas em laboratório. Além de esterilizar instrumentos, os laboratórios C. elegans também podem usar queimadores bunsen para criar um campo estéril para fazer outras tarefas, como derramar placas ou vacinar culturas¹³. No entanto, se isso cria um campo estéril ou atrai contaminantes ainda viáveis permanece controverso¹⁴. Embora não seja uma opção em todas as instituições, um armário de biossegurança ou capô de fluxo laminar pode ser usado para esses fins, permitindo que um laboratório funcione sem o uso de chamas abertas. Manuais de instrução para a maioria dos micro-incineradores recomendam o uso para esterilização de lâminas de bisturi porque a raspagem das paredes internas danifica o esterilizador. No entanto, se usar cuidadosamente um guia, pode-se esterilizar uma lâmina de bisturi ou espátula sem tocar nas paredes internas. Isso amplia o uso da técnica para permitir a escoamento sem o uso de uma chama e permite que um laboratório C. elegans funcione sem alternar técnicas entre esterilizar diferentes objetos.

Conforme descrito na Tabela 1, os micro-incineradores oferecem maior segurança, maior compatibilidade com capô de fluxo laminar e maior portabilidade sobre métodos baseados em chama, mas têm limitações. Eles são mais caros do que os outros métodos e requerem um tempo de aquecimento antes que as temperaturas de esterilização sejam alcançadas. Em conclusão, este método que é rotineiramente utilizado em muitos laboratórios de microbiologia, pode ser aplicável em alguns laboratórios de pesquisa e ensino de C. elegans que buscam melhorar a segurança laboratorial sem comprometer a esterilidade.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
90% platina 10% fio de irídio	Tritech	PT-9010	Outras fontes e composições de fios podem ser usadas.
Agarose	Sigma Aldrich	A6013	LB ingrediente de ágar
Bico de Bunsen	Fisher Scientific	50-110-1225	Outros queimadores de Bunsen podem ser usados
Lâmpada de etanol	Carolina	706604	Incluído aqui como referência à Tabela 1
Isqueiro	Carolina	706636	Incluído aqui como referência à Tabela 1
Acessório de suporte de laço	Fisher	22-630-002	Referido no manuscrito como "guia"
Micro-incinerador	Thomas Scientific	1154J15	Existem muitas empresas que vendem equipamentos semelhantes. Modelos semelhantes também vendidos pela Benchmark Scientific (B1001),  Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400) e BT Lab Systems (BT1702).
N2 vermes	CGC	N2
NaCl	Sigma Aldrich	S5886	LB ingrediente
OP50 E. coli	CGC	OP50
placa de Petri	Fisher	08-772B
Pick handle	Tritech	TWPH1
Lâmina de bisturi	Fisher	12-000-161
Punho de bisturi	Fisher	12-000-164
Espátula	Fisher	14-374	Outras espátulas funcionarão
Espalhadores de células estéreis	VWR	76206-438	Outros espalhadores de células podem ser usados desde que sejam estéreis
Triptona	Sigma Aldrich	T7293	LB ingrediente
Extrato de levedura	Sigma Aldrich	Y1625	LB ingrediente