Detta protokoll beskriver en iSCAT-baserad bildbehandling och enpartikelspårningsmetod som möjliggör samtidig undersökning av molekylmassan och det diffusiva beteendet hos makromolekyler som interagerar med lipidmembran. Steg-för-steg-instruktioner för provberedning, mass-till-kontrastkonvertering, filmförvärv och efterbehandling tillhandahålls tillsammans med anvisningar för att förhindra potentiella fallgropar.
Kortlivade eller övergående interaktioner mellan makromolekyler vid och med lipidmembran, ett gränssnitt där en mängd väsentliga biologiska reaktioner äger rum, är i sig svåra att bedöma med vanliga biofysiska metoder. Införandet av masskänslig partikelspårning (MSPT) utgör ett viktigt steg mot en grundlig kvantitativ karakterisering av sådana processer. Tekniskt sett möjliggjordes detta genom tillkomsten av interferometrisk spridningsmikroskopi (iSCAT) -baserad massfotometri (MP). När strategin för borttagning av bakgrund är optimerad för att avslöja den tvådimensionella rörelsen hos membranassocierade partiklar, möjliggör denna teknik realtidsanalys av både diffusion och molekylmassa av omärkta makromolekyler på biologiska membran. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för att utföra och analysera masskänslig partikelspårning av membranassocierade system. Mätningar utförda på en kommersiell massfotometer uppnår tidsupplösning i millisekundregimen och, beroende på MP-systemet, en massdetekteringsgräns ner till 50 kDa. För att visa upp MSPT:s potential för en fördjupad analys av membrankatalyserad makromolekyldynamik i allmänhet presenteras resultat erhållna för exemplifierande proteinsystem såsom den ursprungliga membraninteraktionen annexin V.
En gång bara uppfattad som en barriär mot det stora utbudet av omgivande fysiska förhållanden, betraktas biologiska membran numera som funktionella enheter och katalytiska plattformar 1,2. Baserat på deras förmåga att lokalisera, förstärka och rikta signaler som svar på membranassocierade makromolekylreaktioner utgör lipidgränssnitt ett avgörande element för en mängd olika cellulära processer såsom membranhandel och signalkaskader 3,4,5. Membranbindning fungerar som en kärnbildningsplats för montering av stabila komplex och är ofta beroende av en dynamisk jämvikt mellan membranassocierade och cytosoliska former av makromolekyler och är därför av övergående natur 6,7.
Trots deras stora betydelse inom biologin har det hittills varit utmanande att utveckla metoder som kan ge tillgång till de kompositionella, rumsliga och tidsmässiga heterogeniteterna hos membranassocierade makromolekylreaktioner i realtid 7,8. För att lösa de underliggande molekylära processerna är två experimentella aspekter avgörande: tillräcklig tidsupplösning och enpartikelkänslighet. Därför har ensemblemedeltekniker som fluorescensåtervinning efter fotoblekning (FRAP) men också den mycket känsligare fluorescenskorrelationsspektroskopin (FCS) begränsningar, eftersom de i stor utsträckning frikopplar rumslig information från tidsmässig information9. Ett viktigt steg mot karakteriseringen av individuell molekyldynamik har således varit tillkomsten av enpartikelspårning (SPT) i kombination med högkänslig mikroskopi. I synnerhet har två SPT-metoder visat sig vara effektiva i detta avseende. För det första banade användningen av fluoroforer som etiketter och motsvarande fluorescensdetekteringssystem vägen för nanometerprecision och millisekunds upplösning 10,11,12. För det andra förbättrade spridningsbaserad detektion med hjälp av guldnanopartiklar både lokaliseringsprecision och tidsupplösning till subnanometer- och mikrosekundområdet, respektive 13,14,15,16. Trots de många fördelarna med båda metoderna och deras betydande bidrag när det gäller den mekanistiska förståelsen av membranassocierade system 17,18 har båda teknikerna hittills varit begränsade: de kräver märkning av molekylerna av intresse, vilket potentiellt stör deras ursprungliga beteende och är okänsliga för den molekylära sammansättningen av membranassocierade partiklar 19,20.
Båda dessa begränsningar har nyligen övervunnits genom införandet av en ny interferometrisk spridning (iSCAT)-baserad metod som kallas massfotometri (MP)21,22,23. Denna teknik möjliggör bestämning av massfördelningar i lösningen av biomolekyler enligt deras iSCAT-kontrast vid landning på ett glasgränssnitt. För detektion och karakterisering av mobila molekyler som diffunderar på lipidmembran måste emellertid en mer sofistikerad bildanalysmetod utvecklas. Detta har under tiden implementerats framgångsrikt och gör det möjligt att detektera, spåra och bestämma molekylmassan hos enskilda omärkta biomolekyler som diffunderar på ett lipidgränssnitt 24,25. Kallad dynamisk massfotometri eller masskänslig partikelspårning (MSPT), möjliggör denna teknik nu bedömning av komplexa makromolekylinteraktioner genom att direkt registrera förändringar i molekylmassan hos de spårade enheterna och öppnar därmed nya möjligheter för den mekanistiska analysen av membranassocierad molekyldynamik.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för provberedning, avbildning och den dataanalyspipeline som krävs för MSPT. I synnerhet diskuteras provkrav och potentiella problem som kan uppstå under mätning och analys. Vidare visas den oöverträffade potentialen att analysera membranöveragerande makromolekylsystem genom olika representativa resultat.
Det presenterade protokollet utökar massfotometri21, en teknik som analyserar massan av enskilda biomolekyler som adsorberar på glas, till ett ännu mer mångsidigt verktyg som samtidigt kan mäta massan och diffusionen av omärkta membran-interagerande biomolekyler. Denna analysutvidgning uppnås genom implementering av en modifierad strategi för borttagning av bakgrund anpassad till molekylernas laterala rörelse24,25. I allmänhet är bakgrundsborttagningen av yttersta vikt för iSCAT-baserade metoder, eftersom den starka spridningen av glasytans grovhet utgör det huvudsakliga analyshinderet, och den exakta bestämningen av varje pixels lokala bakgrund är avgörande för kvantifiering av partikelmassa och plats. Förutom bildanalysen anpassad till partikelrörelse fullbordar efterföljande partikeldetektering, banlänkning och dataanalys den nya expansionen av MP till masskänslig partikelspårning (MSPT).
I allmänhet är noggrant rengjorda glasskyddsglas och en ren arbetsmiljö kritiska krav för framgångsrik prestanda för MSPT-experiment. På grund av frånvaron av makromolekylmärkning är den förvärvade signalen i sig icke-selektiv. Rena prover, liksom korrekt provhantering, är därför avgörande för att säkerställa att observationer inte kan misstolkas. I synnerhet, när molekyler med låg molekylvikt undersöks, godkänns kontrollmätningar av proteinfria membran för att bedöma bakgrundsbidrag (kompletterande figur 1). Förutom införandet av kontrollmätningar rekommenderas det därför att följa de förberedelsesteg som visas i figur 2 för varje flödeskammare. När de kombineras kommer dessa säkerhetsåtgärder att säkerställa att den detekterade signalen härrör från biomolekylen av intresse och inte till exempel en förorenad flödeskammare, buffert eller membran.
Förutom försiktighetsåtgärderna när det gäller den experimentella designen måste man också vara försiktig under MSPT-bildbehandling. Under videobearbetning bör värdet för tre parametrar väljas noggrant för att säkerställa korrekta resultat: i) längden på medianfönstret för bakgrundsborttagning, ii) tröskeln för partikeldetektering och iii) den maximala sökradien under länktilldelningen. Ett större medianfönster (i) underlättar i allmänhet separationen av diffusa partiklar från den överlagrade kvasikonstanta bakgrunden. Men för för stora fönsterstorlekar kommer provdrift så småningom att märkas och minska noggrannheten i bakgrundsuppskattningen. Optimala inställningar beror starkt på provegenskaper och mätförhållanden. Ändå kan ett värde på 1 001 användas som en robust utgångspunkt. Tröskelparametern (ii) måste justeras beroende på den lägsta molekylmassa som förväntas i provet. Ett värde under 0,0005 rekommenderas inte för mätningar tagna med massfotometern som används i denna studie. För att påskynda analystiderna kan högre värden väljas om ett prov med hög molekylvikt förväntas. Sökradien i banlänkning (iii) anger det maximala radiella avståndet i pixlar där partikelns förskjutna plats kommer att sökas efter i på varandra följande ramar. Den bör anpassas till den snabbaste partikeln i provet, och om det gynnas kan ett adaptivt sökområde (se dokumentation av trackpy) istället användas för att minska beräkningstiden. Speciellt under den inledande fasen av ett projekt rekommenderas att analysera filmerna med olika parametrar för att validera de erhållna resultaten.
Mot bakgrund av MSPT: s enmolekylära natur bör det undvikas att mäta vid höga membranpartikeldensiteter eftersom de kan störa noggrann kontrast och massbestämning. Det har visat sig att densiteter under en partikel per kvadratmikrometer är gynnsamma för MSPT-mätningar24. Ett ytterligare övervägande är de förväntade diffusionskoefficienterna i provet. Även om det är tillämpligt på ett brett spektrum av diffusionskoefficienter har MSPT en lägre gräns för tillgängliga diffusionskoefficienter. Lokal inneslutning till ett område med få pixlar under en betydande del av medianfönsterperioden sammanfogar partikeln med den statiska bakgrunden. För de avbildningsförhållanden som används i detta protokoll rekommenderas inte mätning av diffusionskoefficienter under 0,01 μm2/s. Vid denna diffusionshastighet är till exempel den genomsnittliga kvadratiska förskjutningen av en partikel under medianfönstrets halvstorlek cirka 4 pixlar och därmed av liknande storlek som PSF: s omfattning. Som en konsekvens kommer den statiska bakgrundsuppskattningen sannolikt att innehålla signalbidrag från själva partikeln, vilket resulterar i en till synes minskad kontrast av partikeln tills den så småningom närmar sig ljudnivån. Makromolekyldiffusionskoefficienter mellan 0,05 och 10 μm2/s kan dock tydligt lösas.
För att ytterligare utöka utbudet av MSPT-applikationer kan man föreställa sig en utveckling av den medianbaserade bakgrundsalgoritmen genom eliminering av pixlar som tillfälligt är upptagna med en partikel eller genom korrigering av provavdrift som möjliggör större medianfönsterstorlekar. Båda metoderna skulle lindra problemen med mätningar vid höga partikeldensiteter och långsam diffusion. Förbättringar när det gäller lägre masskänslighet är i horisonten med en ny generation massfotometrar, vilket kan ge tillgång till biomolekyler mindre än 50 kDa. Därför kommer framtida MSPT-experiment att kunna studera enmolekyldynamik och membranrelaterade interaktioner för ett ännu bredare spektrum av membranmimiker som dämpade dubbelskikt och makromolekylära system.
The authors have nothing to disclose.
Vi uppskattar verkligen stödet från Philipp Kukura, Gavin Young och Refeyns programvaruteam och erkänner deras hjälp genom att dela delar av bildanalyskoden. Vi tackar Cryo-EM MPIB Core Facility för att ge tillgång till den kommersiella Refeyn massfotometern. F.S. tar tacksamt emot det stöd och den finansiering som Jürgen Plitzko och Wolfgang Baumeister beviljat. T.H. och P.S. fick finansiering genom Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Project-ID 201269156 – SFB 1032 (A09). N.H. fick stöd av ett DFG-återvändandebidrag HU 2462/3-1. P.S. erkänner stöd genom forskningsnätverket MaxSynBio via det gemensamma finansieringsinitiativet från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) och Max Planck Society.
annexin V | Sigma Aldrich | #SRP8026 | examplary membrane-interacting protein |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad Laboratories Inc. | #5000006 | bradford assay kit to determine protein stock concentrations |
biotin labeled bovine albumin | Sigma Aldrich | #A8549 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
cholera toxin subunit B | Sigma Aldrich | #SAE0069 | examplary membrane-interacting protein |
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102062 | |
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102242 | |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | #850375 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | #870273 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) | Avanti Polar Lipids | #840475 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) | Avanti Polar Lipids | #840035 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
double-sided tape | tesa | #57912-00000-02 | needed for the assembly of glass sample chambers |
Extruder | Avanti Polar Lipids | #610023 | Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions |
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #A39261 | maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT |
Fibronectin (Biotinylated) | Cytoskeleton Inc. | #FNR03-A | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Gel Filtration HMW Calibration Kit | Cytiva | #28403842 | standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT |
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) | Avanti Polar Lipids | #860065 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) | #31820 | examplary protein to highlight the existence of different protein states |
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | #10003643 | |
Low Autofluorescence Immersion Oil | Olympus K.K. | #IMMOIL-F30CC | |
pET21a-Streptavidin-Alive | Addgene | #20860 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
pET21a-Streptavidin-Dead | Addgene | #20859 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29339 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Pierce Protein A, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29989 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Refeyn Acquire | Refeyn Ltd. | control software for Refeyn OneMP | |
Refeyn One | Refeyn Ltd. | – | mass photometer |
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane | VWR International | #514-0063 | needed to filter particles from the buffer of interest |
tetravalent streptavidin | Thermo Fisher Scientific | #SNN1001 | tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites |
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle | Cytiva | #110603 | a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT |
Zepto model 2 plasma cleaner | Diener electronic GmbH | – |