Den tredimensionella, serumfria odlingsmetoden för vuxna lacrimalkörtel (LG) stamceller är väl etablerad för induktion av LG-organoidbildning och differentiering i acinar eller duktaltliknande celler.
Lacrimal gland (LG) stamcellsbaserad terapi är en lovande strategi för lacrimal körtel sjukdomar. Avsaknaden av en tillförlitlig, serumfri odlingsmetod för att erhålla ett tillräckligt antal LG-stamceller (LGSC) är dock ett hinder för vidare forskning och tillämpning. Den tredimensionella (3D), serumfria odlingsmetoden för vuxna mus LGSC är väl etablerad och visas här. LGSC: erna kan kontinuerligt passeras och induceras för att differentiera till acinar eller duktalt liknande celler.
För LGSC-primärkulturen smältes LGs från 6-8 veckor gamla möss med dispas, kollagenas I och trypsin-EDTA. Totalt 1 × 104 enskilda celler såddes i 80 μL matrisgel-lacrimal körtelstamcellsmedium (LGSCM) matris i varje brunn på en 24-brunnsplatta, förbelagd med 20 μL matrisgel-LGSCM-matris. Blandningen stelnade efter inkubation i 20 minuter vid 37 °C och 600 μl LGSCM tillsattes.
För LGSC-underhåll delades LGSC odlade i 7 dagar upp i enstaka celler genom dispas och trypsin-EDTA. De enskilda cellerna implanterades och odlades enligt den metod som användes i LGSC-primärkulturen. LGSC kan passeras över 40 gånger och kontinuerligt uttrycka stam- / stamcellsmarkörer Krt14, Krt5, P63 och nestin. LGSC odlade i LGSCM har självförnyelsekapacitet och kan differentieras till acinar eller duktalt liknande celler in vitro och in vivo.
Lacrimal körtelstamceller (LGSC) upprätthåller lacrimal gland (LG) cellförnyelse och är källan till acinar och duktala celler. Därför anses LGSC-transplantation vara ett alternativt tillvägagångssätt för behandling av allvarlig inflammatorisk skada och vattenbrist torr ögonsjukdom (ADDED)1,2,3. Flera odlingsmetoder har tillämpats för att berika LGSC: er. Tiwari et al., separerade och odlade primära LG-celler med användning av kollagen I och matrisgel kompletterat med flera tillväxtfaktorer; LG-cellerna kunde dock inte kontinuerligt odlas4. Med hjälp av tvådimensionell (2D) kultur isolerades mus LG-härledda stamceller av You et al.5 och Ackermann et al. 6, som visat sig uttrycka stam-/stamcellsmarkörgenerna, Oct4, Sox2, Nanog och nestin, och kan subkultureras. Det finns emellertid ingen tydlig indikation på att dessa celler kan differentieras till acinar eller duktala celler, och det finns inget transplantationsexperiment för att verifiera differentieringspotentialen in vivo.
Nyligen isolerades c-kit + dim / EpCAM + / Sca1–/ CD34–/ CD45-celler från mus-LGs genom flödescytometri, som visade sig uttrycka LG-stamcellmarkörer, såsom Pax6 och Runx1, och differentierades till kanaler och acini in vitro. Hos möss med ADDED kan ortotopisk injektion med dessa celler reparera skadade LGs och återställa sekretorisk funktion hos LGs2. Antalet stamceller som isolerades med denna metod var dock litet, och det finns inga lämpliga odlingsförhållanden för att expandera de isolerade LGSC: erna. Sammanfattningsvis måste ett lämpligt odlingssystem upprättas för att effektivt isolera och odla vuxna LGSC med stabil och kontinuerlig expansion för studier av LGSC vid behandling av ADDED.
Organoider härledda från stamceller eller pluripotenta stamceller är en grupp celler som histologiskt liknar de besläktade organen och kan upprätthålla sin egen förnyelse. Efter att musens tarmorganoid framgångsrikt odlades av Sato et al.,2009 7 odlades organoider från andra organ i följd, baserat på Satos odlingssystem, såsom gallblåsan8, lever9, bukspottkörteln10, mage11, bröst12, lunga13, prostata14 och spottkörtel15 . På grund av den höga andelen vuxna stamceller före celldifferentiering i organoidkultur anses den tredimensionella (3D) organoidodlingsmetoden vara optimal för isolering och odling av vuxna stamceller från LG.
Ett LGSC-odlingssystem för vuxna möss etablerades i den aktuella studien genom att optimera den 3D-, serumfria odlingsmetoden. Det är bevisat att LGSC odlade från både normala och ADDED-möss visade en stabil kapacitet för självförnyelse och spridning. Efter transplantation till ADD-mus-LGs koloniserade LGSC: erna de nedsatta LGs och förbättrade tårproduktionen. Dessutom isolerades röda fluorescerande LGSC från ROSA26mT / mG-möss och odlades. Detta arbete ger en tillförlitlig referens för LGSC-anrikning in vitro och LGSC autograft i klinisk tillämpning för ADDED-terapi.
Det finns väletablerade metoder för isolering och in vitro-odling av lacrimala stamceller för lacrimal stamcellsodling och LG-skadereparation. Shatos et al.17 och Ackermannet al. 6 framgångsrikt odlade och subkulturerade lacrimalstamceller från råttor respektive möss med 2D-odlingsmetoder, vilket gör det möjligt att transplantera lacrimalstamceller för behandling av ADDED. Studier på stamceller18 och mesenkymala stamcelle…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (nr 31871413) och två program för Guangdong Science and Technology (2017B020230002 och 2016B030231001). Vi är verkligen tacksamma för de forskare som har hjälpt oss under studien och för personalen som arbetar på djurcentret för deras stöd i djurvården.
Animal(Mouse) | |||
Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
Equipment | |||
Analytical balance | Sartorius | ||
Automatic dehydrator | Thermo | ||
Blood counting chamber | BLAU | ||
Cell Counter | CountStar | ||
CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
Frozen tissue slicer | Lecia | ||
Horizontal centrifuge | CENCE | ||
Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
Inverted microscope | Olympus | ||
Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
Liquid nitrogen container | Thermo | ||
Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
Micropipettor | Gilson | ||
Microwave oven | Panasonic | ||
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
Paraffin slicing machine | Thermo | ||
PCR Amplifier | Eppendorf | ||
pH value tester | Sartorius | ||
4 °C Refrigerator | Haier | ||
Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
-80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
-20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
Ultra pure water purification system | ELGA | ||
Reagent | |||
Animal Experiment | |||
HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
Cell Culture | |||
B27 | Gibco | 17504044 | |
Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
Dispase | BD | 354235 | |
DMEM | Sigma | D6429 | |
DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
NEAA | Gibco | 11140050 | |
N2 | Gibco | 17502048 | |
R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Y-27632 | Selleck | S1049 | |
HE staining & Immunostaining | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
DAPI | Thermo | 62248 | |
Eosin | BASO | 68115 | |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
RT-PCR & qRT-PCR | |||
Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
TRIzol | Magen | R4801-02 | |
Vector Construction & Cell Transfection | |||
Agar | OXID | – | |
Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
Trytone | OXID | – | |
Yeast Extract | OXID | – | |
Primers and Sequence | Company | ||
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
Vector | |||
pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |