आरएनए संपादन की तेजी से पहचान के लिए एक nonsequencing दृष्टिकोण
Summary
एक जीनोमिक पैमाने पर आरएनए संपादन घटनाओं का तेजी से पता लगाना और विश्वसनीय परिमाणीकरण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है और वर्तमान में प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण विधियों पर भरोसा करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए संपादन का पता लगाने की एक सरल, त्वरित और पोर्टेबल विधि के रूप में माइक्रोटेंपेरचर ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (μTGGE) का उपयोग करता है।
Abstract
आरएनए संपादन एक ऐसी प्रक्रिया है जो आरएनए में पोस्टट्रांसक्रिप्शनल अनुक्रम परिवर्तन की ओर ले जाती है। आरएनए संपादन का पता लगाना और परिमाणीकरण मुख्य रूप से सेंगर अनुक्रमण और आरएनए अनुक्रमण तकनीकों पर निर्भर करता है। हालांकि, ये तरीके महंगे और समय लेने वाले हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक पोर्टेबल माइक्रोटेम्पेचर ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (μTGGE) प्रणाली का उपयोग आरएनए संपादन का तेजी से पता लगाने के लिए एक गैर-अनुक्रमण दृष्टिकोण के रूप में किया जाता है। यह प्रक्रिया वैद्युतकणसंचलन के सिद्धांत पर आधारित है, जो न्यूक्लिक एसिड के नमूनों को डीनेचर करने के लिए उच्च तापमान का उपयोग करता है क्योंकि वे पॉलीएक्रिलामाइड जेल में जाते हैं। तापमान की एक श्रृंखला में, एक डीएनए टुकड़ा आंशिक रूप से अलग स्ट्रैंड के लिए पूरी तरह से डबल-फंसे डीएनए का एक ढाल बनाता है और फिर पूरी तरह से अलग किए गए एकल-फंसे हुए डीएनए के लिए। अलग-अलग न्यूक्लियोटाइड आधारों के साथ आरएनए-संपादित साइटें μTGGE विश्लेषण में विभिन्न पिघलने प्रोफाइल का उत्पादन करती हैं। हमने चार संपादित आरएनए टुकड़ों के पिघलने वाले प्रोफाइल और उनके संबंधित गैर-संपादित (जंगली-प्रकार) टुकड़ों के बीच अंतर को चिह्नित करने के लिए μTGGE-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया। पैटर्न समानता स्कोर (पीएएस) की गणना संपादित और गैर-संपादित आरएनए द्वारा उत्पादित बैंड पैटर्न की तुलना करके की गई थी और इसका उपयोग विधि की पुनरुत्पादकता का आकलन करने के लिए किया गया था। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्लेटफ़ॉर्म एक सरल, सरल और लागत प्रभावी तरीके से आरएनए में एकल आधार उत्परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम बनाता है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह विश्लेषण उपकरण नए आणविक जीव विज्ञान निष्कर्षों की सहायता करेगा।
Introduction
जीनोमिक आरएनए में एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (एसएनवी), जिसमें ए-टू-आई, सी-टू-यू और यू-टू-सी वेरिएंट शामिल हैं, आरएनए संपादन घटनाओं का संकेत दे सकते हैं। हालांकि, आरएनए में एसएनवी का पता लगाना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है। परंपरागत रूप से, संपादित से गैर-संपादित आरएनए का अनुपात प्रत्यक्ष अनुक्रमण, एलील-विशिष्ट वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), या उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) दृष्टिकोण 1,2,3,4,5,6 तक पहुंचने के लिए विकृत द्वारा निर्धारित किया जाता है। हालांकि, ये दृष्टिकोण विशेष रूप से समय- या लागत प्रभावी नहीं हैं, और उनकी कम सटीकता, शोर के उच्च स्तर के कारण, आरएनए-आधारित एसएनवी डिटेक्शन 7,8 के लिए तकनीकी बाधाएं पैदा करती है। यहां, हम एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (एसएनपी) की पहचान करने के लिए तापमान ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (टीजीजीई) पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो आरएनए संपादन विश्लेषण के लिए प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण दृष्टिकोण की आवश्यकता को समाप्त करता है।
वैद्युतकणसंचलन जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में बायोमोलेक्यूल्स के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए एक पसंदीदा विधि है। टीजीजीई डबल-फंसे डीएनए टुकड़ों के अलगाव को सक्षम बनाता है जो समान आकार के होते हैं लेकिन अलग-अलग अनुक्रम होते हैं। तकनीक डीएनए टुकड़ों के पिघलने के तापमान में अनुक्रम से संबंधित अंतर और रैखिक तापमान ढाल 9,10 के साथ झरझरा जैल में उनकी गतिशीलता में बाद में परिवर्तन पर निर्भर करती है। डीएनए के टुकड़ों का पिघलना विशिष्ट पिघलने वाले प्रोफाइल उत्पन्न करता है। एक बार जब सबसे कम पिघलने वाले तापमान वाला डोमेन जेल में एक विशेष स्थिति में संबंधित तापमान तक पहुंच जाता है, तो आंशिक रूप से पिघली हुई संरचना में एक हेलिकल संरचना से संक्रमण होता है, और अणु का प्रवास व्यावहारिक रूप से रुक जाएगा। इसलिए, टीजीजीई गतिशीलता (आकार की जानकारी) और डीएनए टुकड़ों (अनुक्रम-निर्भर जानकारी) के तापमान-प्रेरित संरचनात्मक संक्रमण दोनों का उपयोग करता है, जिससे यह डीएनए टुकड़ों के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन जाता है। एक टीजीजीई पिघलने के पैटर्न में विशेषता बिंदु, जो डीएनए अणु के तीन संरचनात्मक संक्रमणों के अनुरूप हैं, स्ट्रैंड प्रारंभिक-पृथक्करण बिंदु, स्ट्रैंड मध्य-पृथक्करण बिंदु, और स्ट्रैंड अंत-पृथक्करण बिंदु (चित्रा 1) हैं। डोमेन के भीतर अनुक्रम भिन्नताएं, यहां तक कि एकल-आधार अंतर, पिघलने के तापमान को प्रभावित करते हैं, इसलिए, विभिन्न अनुक्रमों वाले अणु टीजीजीई विश्लेषण में असतत पिघलने (विकृतीकरण) पैटर्न दिखाएंगे। इसलिए, टीजीजीई का उपयोग जीनोमिक आरएनए में एसएनवी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है और आरएनए संपादन का पता लगाने का एक अमूल्य उच्च-थ्रूपुट तरीका हो सकता है। यह उच्च-थ्रूपुट लाभ खो जाता है जब पारंपरिक जेल वैद्युतकणसंचलन-आधारित टीजीजीई का उपयोग किया जाता है। हालांकि, TGGE का एक छोटा संस्करण, जिसका नाम microTGGE (μTGGE) है, का उपयोग जेल इलेक्ट्रोफोरेटिक समय को छोटा करनेऔर उत्पादकता 11 में 100 गुना वृद्धि के साथ विश्लेषण में तेजी लाने के लिए किया जा सकता है। μTGGE विधि की सादगी और कॉम्पैक्टनेस PalmPAGE12, एक क्षेत्र-लागू, हैंडहेल्ड और सस्ती जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली की शुरूआत से सुधार किया गया है।
यहां, एक नए टीजीजीई-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग चार जीनों में तीन प्रकार के आरएनए संपादन साइटों (ए-टू-आई, सी-टू-यू, और यू-टू-सी) की जांच करने के लिए किया जाता है, जिसमें दो एराबिडोप्सिस थैलियाना ऊतकों से और दो स्तनधारी HEK293 कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में व्यक्त किए गए हैं। प्रोटोकॉल PalmPAGE (हार्डवेयर) के उपयोग को एकीकृत करता है, जो आरएनए संपादन का तेजी से पता लगाने के लिए एक पोर्टेबल सिस्टम है, और uMelt (सॉफ़्टवेयर)13। 15-30 मिनट के औसत रन-टाइम के साथ, यह प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण दृष्टिकोण की आवश्यकता के बिना आरएनए संपादन की तेजी से, विश्वसनीय और आसान पहचान को सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आरएनए संपादन जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, क्रोमैटोग्राफी और अनुक्रमण जैसे आरएनए संपादन का पता लगाने के वर्तमान तरीके, उनकी उच्च लागत, अत्यधिक समय आवश्यकताओं और जटिलता के क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (17H02204 और 18K19288) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड द्वारा समर्थित किया गया था। रुचिका को जापानी सरकार (एमईएक्सटी छात्रवृत्ति) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। हम वैद्युतकणसंचलन से संबंधित प्रयोगों में मदद के लिए सुश्री राधिका बियानी (ताकागी प्रयोगशाला, जेएआईएसटी) और डॉ कीर्ति शर्मा (बायोसीड्स कॉर्पोरेशन) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
Referências
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