מפות מיקוריזאליות ככלי לחקור דפוסי התיישבות ואסטרטגיות פטרייתיות בשורשים של Festuca rubra ו - Zea mays
Summary
הפרוטוקול כאן מתאר את השיטות להערכת דפוסי ההתיישבות המיקוריזאלית הארבוסקולרית והאסטרטגיה בשורשים לשני מינים: Zea mays ו-Festuca rubra. השימוש בשיטת MycoPatt מאפשר חישוב פרמטרים, המרה של מבנים מיקוריזאליים לנתונים דיגיטליים ומיפוי מיקומם האמיתי בשורשים.
Abstract
פטריות מיקוריזאליות ארבוסקולריות הן סימביונטים בשורשי הצמחים. תפקידם הוא לשמר את התפתחות המארחים ולשמור על שיווי המשקל התזונתי במערכות האקולוגיות. תהליך ההתיישבות תלוי במספר גורמים כמו אקולוגיה של הקרקע, המגוון הגנטי של הפטריות והפונדקאי, ופרקטיקות אגרונומיות. פעולתם המסונכרנת מובילה להתפתחות רשת היפאלית מורכבת ומובילה להתפתחות משנית של שלפוחיות וארבוסקולות בתאי השורש. מטרת מחקר זה הייתה לנתח את היעילות של שיטת תבניות המיקוריזה (MycoPatt) למיקום מבנים פטרייתיים בשורשים של Festuca rubra ו – Zea mays. מטרה נוספת הייתה לחקור את אסטרטגיית ההתיישבות הפטרייתית כפי שהיא מתגלה במפות מיקוריזאליות של כל מין. הרכישה וההרכבה של תמונות מיקרוסקופיות מרובות מאפשרות הערכת התיישבות מיקוריזאלית הן בצמחי תירס והן בצמחי צואה אדומה כדי לספק מידע על המיקום המציאותי של המבנים המפותחים. דפוסי המיקוריזה שנצפו מדגישים את היעילות המשתנה של כל צמח במונחים של פיתוח קשרים עם פטריות סימביוטיות בקרקע, הנגרמות על ידי טיפולים יישומיים ושלב הצמיחה. מפות מפורטות של מיקוריזאל המתקבלות בשיטת MycoPatt שימושיות לגילוי מוקדם של יעילות הצמח ברכישה סימביוטית מהקרקע.
Introduction
פטריות מיקוריזה ארבוסקולריות (AM) הן קטגוריה של אנדופיטים הנישאים בקרקע ומהווים כל הזמן תחום עניין עבור חוקרים. נוכחותם בשורשים של רוב הצמחים ומעורבותם במחזורי חומרי מזון הופכת אותם למרכיבים חיוניים ביציבות של כל מערכת אקולוגית שבה נמצאים צמחים עשבוניים 1,2. באמצעות התפטיר החוץ-רדיקולרי שלהם, AM משמש כהרחבה פטרייתית לשורשי צמחים, במיוחד באזורים שקשה להגיע אליהם3. הפעילות העיקרית היא בשורשי צמחים מארחים, שם AM מפתחת רשתות גדולות של מקף ומבנים תוך-תאיים ספציפיים הנקראים ארבוסקולים. חוסר הספציפיות של המארח מאפשר לסימביונט ליישב מספר מינים בו זמנית. יכולת זו מספקת ל-AM את התפקיד של הקצאת משאבים וויסות חומרים מזינים במערכת האקולוגית; הפטרייה גם מספקת תמיכה בהישרדות הצמחים ומסייעת בביצועי הצמח 4,5,6,7. התגובה של מיני AM לשורשים מארחים נראית בהרחבה ובמיקום של התפטיר התוך-רדיקולרי והנוכחות והצורה של הארבוסקולים התפתחו תוך תאיים. הארבוסקולים התוך-תאיים משמשים כנקודת החלפה בין שני הסימביונטים ומייצגים אזורים המאופיינים בתהליכי העברה מהירים. המבנים שה-AM מייצרים הם תלויי מינים, ובנוסף לארבוסקולים, בשורשים, הם מפתחים גם שלפוחיות, נבגים ותאי עזר.
ישנם אתגרים רבים בהערכת סימביונטים של AM בשורשי צמחים 8,9. הראשון הוא ההתפתחות המתמדת שלהם במהלך כל תקופת הצמחייה של המארחים, מה שמוביל לשינויים מרובים במבנה הארבוסקולרי ההיפלי. השלבים השונים של הצמיחה הארבוסקולרית, עד לקריסתם, נמצאים בבירור בשורשים, אך מבני AM הסנסנטיים מתעכלים לפעמים, מה שהופך אותם לנראים רק באופן חלקי10. האתגר השני מיוצג על ידי שיטת הצביעה והפרוטוקול, המגוון הגדול של מערכות השורשים, ממד התאים שלהן וההבדלים בעובי, המקשים על הצעת שיטה אחידה. האתגר האחרון מיוצג על ידי הערכה וניקוד של קולוניזציה AM. ישנן שיטות רבות המבקיעות AM בדרגות שונות של אובייקטיביות, ורובן עדיין מוגבלות לטכניקות מיקרוסקופיה. הפשוטים מבוססים על נוכחות/היעדר מבנים בקליפת השורש, ואילו המורכבים יותר מבוססים על ניקוד חזותי ושימוש במחלקות קולוניזציה, תוך אינטגרציה של התדירות והעוצמה של תופעת הקולוניזציה. הרבה נתונים הופקו בעשורים האחרונים על מצב המיקוריזה של מינים מרובים, אך רוב השיטות מוגבלות לערך הנצפה של קולוניזציה מבלי להצביע על המיקום האמיתי של כל מבנה בקליפת השורש. כתגובה לצורך בתוצאות מדויקות יותר על התיישבות AM, פותחה שיטה המבוססת על ניתוח מיקרוסקופי של תבניות מיקוריזאליות (MycoPatt) בשורשים כדי להרכיב, בצורה דיגיטלית, את מפות המיקוריזאל המפורטות11. כמו כן, השיטה מאפשרת חישוב אובייקטיבי של פרמטרי קולוניזציה וקביעת המיקום בפועל של כל מבנה בשורש.
המיקום של מבנים פטרייתיים AM יכול להיות חשוב לענות על שתי השאלות הבאות. הראשון קשור לניתוח הקולוניזציה ברגע מסוים אחד ממחזור הצמחייה של הצמח. בהקשר זה, כדאי מאוד להתבונן בשפע הארבוסקולרי/שלפוחית, לדווח כיצד הם ממוקמים בשורש, ולספק תמונת קולוניזציה ופרמטרים ברורים מאוד. השני קשור לזיהוי אסטרטגיה פטרייתית והאוריינטציה שלה ואפילו לתחזית התפתחותה העתידית. יישום אחד של MycoPatt יכול להיות עבור צמחים מנותחים מדי יום, כל 2-3 ימים, מדי שבוע, או במהלך שלבי צמיחה שונים. בהקשר זה, מיקום הבועיות/ארבוסקולות חשוב כדי להבין טוב יותר את המנגנון הביולוגי של התיישבות AM. פרמטרים ותצפיות אלה שימושיים מאוד כדי להשלים את הפרמטרים המתמטיים.
מטרת מאמר זה היא להדגים את יכולתה של מערכת MycoPatt לחקור את הפוטנציאל והאסטרטגיה של התיישבות פטריות AM בשורשי Zea mays (תירס) בשלבי התפתחות שונים ובשורשי Festuca rubra (צואה אדומה) בתנאי הפריה ארוכי טווח שונים. כדי להגשים את המטרה נותחו שני מאגרי מידע גדולים משני ניסויים. ניסוי התירס נערך בקוג’וצ’נה (46°44′56″ lat. N ו-23°50′0″ אורך). E), בחווה הדידקטית הניסויית של האוניברסיטה למדעי החקלאות והרפואה הווטרינרית קלוז’ על פאוזיום עם אדמה מרקם שמנמן12. ניסוי הצואה האדומה הוא חלק מאתר ניסוי גדול יותר שהוקם בשנת 2001 בגהשארי, הרי אפוסני (46°49’064″ lat. N ו-22°81’418”’ אורך). E), על אדמת פרלובוסול (טרה רוסה) סוג13,14. התירס נאסף בחמישה פנופאזות גדילה שונות12: B1 = 2-4 עלים (כנקודת בקרה לתחילת ההתיישבות המיקוריזאלית); B2 = 6 עלים; B3 = 8-10 עלים; B4 = היווצרות cob; B5 = בגרות פיזיולוגית. החל משלב 2-4 העלים (A0), הוחל טיפול אורגני, שהביא לגורם שני סיום (A1 = בקרה ו- A2 = מטופל). שורשים של צואה אדומה נאספו בפריחה מניסוי עם חמש הפריות ארוכות טווח13,14: V1 = בקרה, לא מופרית; V2 = 10 t·ha-1 זבל; V3 = 10 t·ha-1 זבל + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 זבל + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. בכל שלב נאספו חמישה צמחים מכל גרסת הפריה. פרוטוקולי הצביעה וביצועיהם מבחינת זמן עיבוד הדגימה ואיכות הכתמים נותחו. הקשר בין התפתחות AM hyphae לבין נוכחות המבנים שלו בשורשים נותח בנפרד עבור כל מין והמשיך בזיהוי השורשים המתירניים ביותר להתיישבות. דפוסי הקולוניזציה הספציפיים של כל מערכת שורשים נותחו על סמך מפות קולוניזציה והערך של פרמטרי AM.
תירס הוא צמח שנתי, אשר מרמז על צמיחה מתמשכת של השורשים, וזה היה הסיבה העיקרית ליישם את MycoPatt בשלבי הגידול. צואה אדומה היא צמח רב שנתי ממרעה שטופלה במשך זמן רב בדשנים שונים. לשורשיו יש התפתחות קצרה יותר של שנה, והאנתזה נחשבת לנקודת הצמחייה כאשר הצמח משנה את חילוף החומרים שלו מווגטטיבי לגנרטיבי. כדי לתפוס צמחים אלה במהלך תקופות פעילות אינטנסיביות אלה, נבחרו נקודות הזמן הנ”ל. דיגום בתקופת הצמחייה קשה למין זה כאשר הוא גדל בערבות טבעיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים על התיישבות מיקוריזאלית חיוניים לפיתוח אסטרטגיה חדשה בתחום האגרונומי. הפוטנציאל של צמחים מעובדים מרובים ליצור קשר סימביוטי עם מיקוריזות ארבוסקולריות הפך אותם למרכיב חשוב בפיתוח בר-קיימא של המערכת החקלאית ובשמירה על בריאותה 16,17,18,19,20.<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מאמר זה משתמש בנתונים הנובעים משני מחקרי דוקטורט בתחום התמטי של “תבניות מיקוריזאליות של תירס המונעות על ידי תשומות אגרונומיות”, שנערכו על ידי ויקטוריה פופ-מולדובה, ו”מעמד מיקוריזאלי ופיתוח התיישבות במינים דומיננטיים בערבה הררית”, שנערכו על ידי לריסה קורקוז, בתיאום של פרופ’ רוקסנה וידיקן.
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
Referências
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M., Hock, B. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Mycota. IX Fungal Associations. , 51-75 (2012).
- Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).
- Gianinazzi, S., et al. Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Lee, E. -. H., Eo, J. -. K., Ka, K. -. H., Eom, A. -. H. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems. Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).
- Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).
- Shah, A. A., et al. Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum. Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).
- Souza, T. . Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , (2015).
- Sun, X. -. G., Tang, M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).
- Smith, S., Read, D., Smith, S. E., Read, D. J. Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza. Mycorrhizal Symbiosis. , 42-90 (2008).
- Stoian, V., et al. Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots. Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).
- Pop-Moldovan, V., et al. Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment. Plants. 10 (12), 2760 (2021).
- Corcoz, L., et al. Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland. Plants. 11 (1), 112 (2021).
- Corcoz, L., et al. Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra. Agronomy. 12 (3), 650 (2022).
- Stoian, V., Florian, V. Mycorrhiza – Benefits, influence, diagnostic method. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).
- Prates Júnior, P., et al. Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity. PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture. Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).
- Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S., Gehlot, P., Singh, J. Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem. Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. , 205-220 (2018).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
- Vaida, I., Păcurar, F., Rotar, I., Tomoș, L., Stoian, V. Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland. Plants. 10 (4), 739 (2021).
- . The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi Available from: https://invam.wvu.edu/collection (2022)
- . The International Bank for the Glomeromycota Available from: https://www.i-beg.eu/ (2022)
