Mapas de micorrizas como herramienta para explorar patrones de colonización y estrategias fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays
Summary
El protocolo aquí describe los métodos para la evaluación de los patrones de colonización de micorrizas arbusculares y la estrategia en raíces para dos especies: Zea mays y Festuca rubra. El uso del método MycoPatt permite el cálculo de parámetros, la conversión de estructuras micorrízicas en datos digitales y el mapeo de su posición real en raíces.
Abstract
Los hongos micorrízicos arbusculares son simbiontes en las raíces de las plantas. Su función es sostener el desarrollo del huésped y mantener el equilibrio nutricional en los ecosistemas. El proceso de colonización depende de varios factores como la ecología del suelo, la diversidad genética de los hongos y el huésped, y las prácticas agronómicas. Su acción sincronizada conduce al desarrollo de una compleja red hifal y conduce al desarrollo secundario de vesículas y arbúsculos en las células de la raíz. El objetivo de esta investigación fue analizar la eficiencia del método de patrones micorrícicos (MycoPatt) para el posicionamiento de estructuras fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays. Otro objetivo fue explorar la estrategia de colonización fúngica revelada por los mapas micorrícicos de cada especie. La adquisición y ensamblaje de múltiples imágenes microscópicas permite la evaluación de la colonización micorrízica tanto en plantas de maíz como de festuca roja para proporcionar información sobre la posición realista de las estructuras desarrolladas. Los patrones micorrízicos observados resaltan la eficiencia variable de cada planta en términos de desarrollar conexiones con hongos simbióticos del suelo, causados por los tratamientos aplicados y la etapa de crecimiento. Los mapas detallados de micorrizas obtenidos a través del método MycoPatt son útiles para la detección temprana de la eficiencia de la planta en la adquisición simbiótica del suelo.
Introduction
Los hongos micorrizas arbusculares (AM) son una categoría de endófitos transmitidos por el suelo que son constantemente un área de interés para los investigadores. Su presencia en las raíces de la mayoría de las plantas y su participación en los ciclos de nutrientes los convierte en componentes vitales en la estabilidad de todos los ecosistemas donde las plantas herbáceas están presentes 1,2. A través de su micelio extrarradicular, AM actúa como una extensión fúngica para las raíces de las plantas, especialmente en áreas de difícil acceso3. La actividad principal es en las raíces de la planta huésped, donde la AM desarrolla grandes redes de hifas y estructuras intracelulares específicas llamadas arbúsculos. La falta de especificidad del huésped permite que el simbionte colonice múltiples especies al mismo tiempo. Esta capacidad proporciona a la AM el papel de la asignación de recursos y la regulación de nutrientes en el ecosistema; El hongo también proporciona apoyo en la supervivencia de la planta y ayuda en el rendimiento de la planta 4,5,6,7. La reacción de las especies AM a las raíces huésped es visible en la extensión y localización del micelio intrarradicular y la presencia y forma de los arbúsculos desarrollados intracelularmente. Los arbúsculos intracelulares actúan como un punto de intercambio entre los dos simbiontes y representan áreas caracterizadas por procesos de transferencia rápida. Las estructuras que produce la AM dependen de la especie y, además de los arbúsculos, en las raíces, también desarrollan vesículas, esporas y células auxiliares.
Existen muchos desafíos en la evaluación de simbiontes AM en raíces de plantas 8,9. El primero es su desarrollo constante durante todo el período vegetativo de los huéspedes, lo que conduce a múltiples cambios en la estructura arbuscular hifal. Las diferentes etapas del crecimiento arbuscular, hasta su colapso, están claramente presentes en las raíces, pero las estructuras AM senescentes a veces se digieren, lo que las hace solo parcialmente visibles10. El segundo desafío está representado por el método y el protocolo de tinción, la gran diversidad de sistemas radiculares, la dimensión de sus células y las diferencias de grosor, que dificultan la propuesta de un método unificado. El último desafío está representado por la evaluación y puntuación de la colonización AM. Existen numerosos métodos que puntúan AM con diferentes grados de objetividad, y la mayoría de ellos todavía están restringidos a las técnicas de microscopía. Los simples se basan en la presencia/ausencia de estructuras en la corteza radicular, mientras que los más complejos se basan en la puntuación visual y el uso de clases de colonización, con la integración de la frecuencia e intensidad del fenómeno de colonización. Se han producido muchos datos en las últimas décadas sobre el estado micorrízico de múltiples especies, pero la mayoría de los métodos se limitan al valor observado de la colonización sin apuntar a la posición real de cada estructura en la corteza radicular. Como respuesta a la necesidad de resultados más precisos sobre la colonización de AM, se desarrolló un método basado en el análisis microscópico de patrones de micorrizas (MycoPatt) en raíces para ensamblar, en forma digital, los mapas micorrícicos detallados11. Además, el método permite el cálculo objetivo de los parámetros de colonización y la determinación de la posición real de cada estructura en la raíz.
La posición de las estructuras fúngicas AM puede ser importante para responder a las siguientes dos preguntas. El primero está relacionado con el análisis de la colonización en un momento específico del ciclo vegetativo de una planta. En este contexto, es muy útil observar la abundancia arbuscular/vesicular, informar cómo se ubican en la raíz y proporcionar una imagen y parámetros de colonización muy claros. El segundo está relacionado con la detección de la estrategia fúngica y su orientación e incluso la previsión de su desarrollo futuro. Una aplicación del MycoPatt puede ser para plantas analizadas diariamente, cada 2-3 días, semanalmente o durante varias etapas de crecimiento. En este contexto, la ubicación de las vesículas/arbúsculas es importante para comprender mejor el mecanismo biológico de la colonización AM. Estos parámetros y observaciones son muy útiles para complementar los parámetros matemáticos.
El objetivo de este artículo es demostrar la capacidad del sistema MycoPatt para explorar el potencial y la estrategia de colonización de hongos AM nativos en raíces de Zea mays (maíz) durante diferentes etapas de desarrollo y en raíces de Festuca rubra (festuca roja) bajo diferentes condiciones de fertilización a largo plazo. Para cumplir con el objetivo, se analizaron dos grandes bases de datos de dos experimentos. El experimento de maíz se estableció en Cojocna (46°44′56″ lat. N y 23°50′0″ de largo. E), en la Granja Didáctica Experimental de la Universidad de Ciencias Agrícolas y Veterinarias de Cluj sobre un feozión con un suelo de textura arcillosa12. El experimento de la festuca roja es parte de un sitio experimental más grande establecido en 2001 en Ghețari, montañas Apuseni (46 ° 49’064 “lat. N y 22 ° 81’418 ” de largo. E), sobre un suelo preluvosol (terra rossa) tipo13,14. El maíz se recolectó en cinco fenofases de crecimiento diferentes12: B1 = 2-4 hojas (como punto de control para el inicio de la colonización micorrízica); B2 = 6 hojas; B3 = 8-10 hojas; B4 = formación de mazorca; B5 = madurez fisiológica. A partir de la etapa de 2-4 hojas (A0), se aplicó un tratamiento orgánico, que resultó en un factor de dos graduación (A1 = control y A2 = tratado). Las raíces de festuca roja fueron recolectadas en la floración de un experimento con cinco fertilizaciones a largo plazo13,14: V1 = control, no fertilizada; V2 = 10 t·ha-1 estiércol; V3 = 10 t·ha-1 estiércol + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 estiércol + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. Se recolectaron cinco plantas en cada etapa de desarrollo de cada variante de fertilización. Se analizaron los protocolos de tinción y su rendimiento en términos de tiempo de procesamiento de la muestra y calidad de la tinción. La relación entre el desarrollo de las hifas AM y la presencia de sus estructuras en las raíces se analizó por separado para cada especie y se continuó con la identificación de las raíces más permisivas para la colonización. Los patrones de colonización específicos de cada sistema radicular se analizaron en base a mapas de colonización y el valor de los parámetros AM.
El maíz es una planta anual, lo que implica un crecimiento continuo de las raíces, y esa fue la razón principal para aplicar el MycoPatt en las etapas de crecimiento. La festuca roja es una planta perenne de un pastizal tratada durante mucho tiempo con diferentes fertilizantes. Sus raíces tienen un desarrollo más corto de 1 año, y la antesis se considera como el punto de vegetación cuando la planta cambia su metabolismo de vegetativo a generativo. Para capturar estas plantas durante estos intensos períodos de actividad, se eligieron los puntos de tiempo mencionados anteriormente. El muestreo durante el período de vegetación es difícil para esta especie cuando se cultiva en pastizales naturales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios sobre la colonización micorrízica son vitales para el desarrollo de nuevas estrategias en el campo agronómico. El potencial de múltiples plantas cultivadas para formar una asociación simbiótica con las micorrizas arbusculares las convirtió en un componente importante del desarrollo sostenible del agroecosistema y del mantenimiento de su salud 16,17,18,19,20.<sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este artículo utiliza datos resultantes de dos estudios de doctorado en el área temática de “Patrones de micorrizas de maíz impulsados por insumos agronómicos”, realizados por Victoria Pop-Moldovan, y “Estado de micorrizas y desarrollo de la colonización en especies dominantes de pastizales de montaña”, realizado por Larisa Corcoz, bajo la coordinación de la Prof. Dra. Roxana Vidican.
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
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