Den presenterade metoden erbjuder ett innovativt sätt att konstruera biomimetiska fiberstrukturer i tredimensionella (3D) ställningar (t.ex. hjärtklaffbroschyrer). 3D-printade, ledande geometrier användes för att bestämma form och dimensioner. Fiberorientering och egenskaper var individuellt justerbara för varje lager. Flera prover kan tillverkas i en installation.
Elektrospinning har blivit en allmänt använd teknik inom kardiovaskulär vävnadsteknik eftersom det ger möjlighet att skapa (mikro-) fibrösa ställningar med justerbara egenskaper. Syftet med denna studie var att skapa flerskiktade byggnadsställningar som efterliknar de arkitektoniska fiberegenskaperna hos mänskliga hjärtklaffbroschyrer med hjälp av ledande 3D-tryckta samlare.
Modeller av aortaklaffkusps skapades med hjälp av kommersiell CAD-programvara (Computer Aided Design). Ledande polymjölksyra användes för att tillverka 3D-tryckta bipacksedelmallar. Dessa cusp-negativ integrerades i en speciellt utformad, roterande elektrospinning dorn. Tre lager polyuretan snurrades på kollektorn och efterliknade fiberorienteringen hos mänskliga hjärtklaffar. Yt- och fiberstrukturen bedömdes med ett svepelektronmikroskop (SEM). Appliceringen av fluorescerande färgämne möjliggjorde dessutom mikroskopisk visualisering av den flerskiktade fiberstrukturen. Dragprovning utfördes för att bedöma byggnadsställningarnas biomekaniska egenskaper.
3D-utskrift av väsentliga delar till elektrospinningriggen var möjlig på kort tid för en låg budget. Aortaklaffens kuspar som skapades efter detta protokoll var treskiktade, med en fiberdiameter på 4,1 ± 1,6 μm. SEM-avbildning avslöjade en jämn fördelning av fibrer. Fluorescensmikroskopi avslöjade enskilda lager med olika inriktade fibrer, där varje lager exakt nådde den önskade fiberkonfigurationen. De producerade byggnadsställningarna visade hög draghållfasthet, särskilt längs inriktningsriktningen. Utskriftsfilerna för de olika samlarna finns som Supplemental File 1, Supplemental File 2, Supplemental File 3, Supplemental File 4 och Supplemental File 5.
Med ett högspecialiserat installations- och arbetsflödesprotokoll är det möjligt att efterlikna vävnader med komplexa fiberstrukturer över flera lager. Att snurra direkt på 3D-printade solfångare skapar stor flexibilitet vid tillverkning av 3D-former till låga produktionskostnader.
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i västländer 1. Även om omfattande forskning görs inom detta område uppskattas det att bördan av degenerativ hjärtklaffsjukdom kommer att öka ytterligare under de närmaste åren2. Kirurgisk eller ingripande hjärtklaffbyte är möjlig som ett terapeutiskt alternativ. Vid denna tidpunkt finns mekaniska och bioprotetiska hjärtklaffar tillgängliga, båda med individuella nackdelar. Mekaniska ventiler är trombogena och kräver livslång antikoagulering. Även om biologiska ventiler inte kräver antikoagulering, visar de brist på ombyggnad, hög förkalkningshastighet och samtidig nedbrytning3.
Vävnadskonstruerade hjärtklaffar kan kanske ta itu med dessa nackdelar genom att införa en mikrofibrös byggnadsställning i kroppen som möjliggör ombyggnad in vivo. Olika metoder, t.ex. elektrospinning (ESP), decellularisering, mikrogjutning, spray, doppbeläggning och 3D-bioprinting, finns tillgängliga. Dessa metoder kan väljas för att skapa specifika egenskaper, vara billigare och snabbare, eller bara på grund av brist på alternativ. Metoder och material kan till och med kombineras för att skapa mer komplexa strukturer4. ESP har till exempel varit en standardteknik för att skapa byggnadsställningar inom vävnadsteknik, vilket möjliggör kombinationen av olika material och justering av fiberdiametrar, fiberorienteringar och porositeter4. Dessutom möjliggör en mängd olika efterbehandlingstekniker optimerad vävnadsombyggnad, förbättrad hemokompatibilitet och justerbar biologisk nedbrytning av elektrospunna byggnadsställningar 5,6,7.
Grundläggande ESP använder antingen statiska eller roterande kollektorer, som har ett direkt inflytande på graden av fiberinriktning och de erhållna fiberdiametrarna8. På grund av tillverkningsbegränsningar består klassiska ESP-roterande samlare av roterande trummor, skivor, ledningar eller metallstavar. Införandet av 3D-printing möjliggör skapandet av mer individualiserade kollektorgeometrier som inte begränsas av traditionella tillverkningstekniker. Denna individualisering är särskilt användbar för skapandet av 3D-konstruktioner som hjärtklaffbroschyrer.
Den naturliga treskiktade (fibrosa, spongiosa, ventricularis) arkitekturen hos mänskliga hjärtklaffblad är vävnadernas svar på de mekaniska krafterna och skjuvspänningen de utsätts för under hjärtcykeln 9,10. Fibrerna i lamina fibrosa är orienterade omkrets, medan fibrerna i lamina spongiosa är slumpmässigt inriktade och de hos lamina ventricularis radiellt. Ett trippelskikt med motsvarande fiberorienteringar föreslås således för att efterlikna egenskaperna hos dessa ventiler i en vävnadskonstruerad byggnadsställning.
Arbetsflödesprotokollet beskriver en innovativ metod för att producera treskiktade 3D-hjärtklaffbroschyrer med hjälp av 3D-utskrift och elektrospinning. Dessutom presenteras ett kvalitetskontrollsteg för att säkerställa exakt fiberorientering i varje lager.
Det beskrivna protokollet presenterar två innovationer inom (kardiovaskulär) vävnadsteknik: billig tillverkning av helt 3D-tryckta fantomer för elektrospinning och användningen av en mångsidig kollektor för att producera anpassningsbara, flerskiktade hjärtklaffbroschyrer.
Nyligen har 3D-utskrift blivit ett värdefullt verktyg för produktion av laboratorieutrustning, t.ex. bioreaktorer eller tillverknings- och testinställningar11,12. Därför var det möjligt att tillverka elektrospinningsinställningen som presenterades i denna studie på kort tid och för en överkomlig budget (tabell 1). Detta ligger i linje med tidigare resultat för billig produktion av elektrospinningsinställningar med hjälp av 3D-utskrift13.
Dessutom, såvitt författarna vet, är detta första gången som ett ledande 3D-utskriftsmaterial användes för att skapa en elektrospinningsuppsamlare för hjärtklaffblad. Hittills har 3D-printade kollektorer antingen tillverkats genom metalllasersintring14 eller med användning av icke-ledande polymerutskrift och efterföljande efterbehandling med en ledande beläggning15. I motsats till detta nya tillvägagångssätt har dessa förfaranden en betydande nackdel eftersom de är dyrare, tar mycket längre tid eller kräver mer manuellt arbete.
Elektrospinning beror på en mängd variabler som påverkar morfologin hos de skapade fibrerna. Även om olika kommersiella elektrospinningsinställningar finns tillgängliga på marknaden, använder många forskargrupper mycket individualiserade inställningar för att matcha deras specifika behov16. Med hänsyn till detta kan de beskrivna värdena i detta protokoll (spänning, avstånd och rotationshastighet) behöva anpassas för enskilda inställningar och bör ses som en utgångspunkt snarare än fasta värden. Vidare är det känt att miljöparametrar kan ha ett betydande inflytande på elektrospinningsresultat 17,18. Därför rekommenderas det starkt att kontrollera åtminstone temperatur och fuktighet i elektrospinningriggen. Optimala elektrospinningsresultat erhölls mellan 15-20% relativ fuktighet vid en temperatur mellan 21 och 24 °C. För att följa detta protokoll är följande utrustning nödvändig: en motor som kan accelerera en kollektor som väger cirka 300 g till en varvtal på 2 000 rpm, en sprutpump som är lämplig för små volymflöden på 1-3 ml / h och en dubbelpolig strömförsörjningsenhet som kan ±20 kV likström (DC).
I linje med tidigare studier var det möjligt att visualisera den fibrösa strukturen hos de elektrospunna byggnadsställningarna genom fluorescensmikroskopi19. Det var möjligt att framgångsrikt demonstrera ställningens flerskiktade struktur, inklusive de varierande fiberorienteringarna. Speciellt när man arbetar med flera lager eller flera material bör införandet av fluorescerande färgämnen betraktas som ett standardförfarande för strikt kvalitetskontroll. Det kan förbättra den visuella bedömningen av resultat efter ändringar i parametrarna eller arbetsflödesprotokollet. Applicering av färgämne i byggnadsställningar som ska användas för in vivo – eller in vitro-bedömning kan inte rekommenderas. Detta är viktigt för att undvika störningar i etablerade analysmetoder.
Att efterlikna naturlig hjärtklaffmorfologi är av stor betydelse för att producera en vävnadskonstruerad replikat som ska användas som hjärtklaffprotes (figur 4B). Det har visat sig att den specifika ventilgeometrin har stor inverkan på in vivo-ombyggnad 20. I detta sammanhang är 3D-utskrift av bipacksedelgeometrin för elektrospinning en fördel, eftersom iterationer är enkla och snabba att implementera. Även produktion av personliga ventilgeometrier är tänkbar och efterföljande utveckling av individuella och personliga 3D-modeller av hjärtklaffavvikelser, till exempel för undervisningsändamål, är möjlig.
Ytterligare förbättring av vävnadskonstruerade hjärtklaffegenskaper står i centrum för nuvarande forskningsinsatser, eftersom flera forskargrupper har arbetat med att utveckla flerskiktade ställningar med definierade fiberorienteringar. tillverkade kompositställningar från ett gjutet polyglycerolebakatskikt och elektrospunna polykaprolakton (PCL) fibermattor21. Således kan ett trippelskikt skapas av två orienterade elektrospunna skikt åtskilda av ett ark mikrofabricerat polyglycerolsebakat. Men i motsats till byggnadsställningarna till hands var de varken i 3D-form eller efterliknade tillräckligt mellanskiktet (spongiosa). Ett annat tillvägagångssätt för att producera en bioinspirerad vävnadskonstruerad hjärtklaff följdes av Jana et al.22,23. De producerade framgångsrikt trippelskiktade ställningar med orienterade fibrer med aluminiumsamlare för PCL-baserad elektrospinning. Återigen presenterade dessa byggnadsställningar också morfologiska brister, eftersom de bara har ett 2D-utseende, och den slutliga ställningen genomsyras av ekrar.
Även om protokollet ger detaljerad information om hur 3D, trippelskiktade hjärtklaffbroschyrer produceras, finns det flera fler steg som behövs för att skapa en verklig hjärtklaffprotes. En stent med 24 mm diameter rekommenderas för de broschyrer som beskrivs här. Komplement till den använda stenten kan broschyrerna förses med ytterligare stödstrukturer för sömnad. För att möjliggöra maximal flexibilitet är broschyrerna som visas här inte individualiserade till en specifik stentdesign. Detta kan göras genom att helt enkelt ändra mallen med CAD-programvara.
Även om den används för hjärtklaffvävnadsteknik, kommer den presenterade metoden att vara lätt tillämplig för elektrospinningsinställningar inom ortopedi24, urologi25, otolaryngologi26 och andra. Produktionen av sofistikerade och / eller individualiserade 3D-konstruktioner är möjlig genom implementering av andra 3D-tryckta samlare. Även om kollektorns material har förändrats förblir principen om elektrospinning intakt27. Därför är användningen av olika polymerer teoretiskt möjlig, även om justering av elektrospinningsparametrarna kan vara nödvändig.
Sammantaget beskriver det presenterade protokollet ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att tillverka flerskiktade hjärtklaffbroschyrer. Tillämpningen av 3D-utskrift möjliggör snabb anpassning och modifiering av kollektorn och insatserna. Detta möjliggör produktion av patientspecifika proteser utan en komplicerad tillverkningsprocess av till exempel metallsamlare. Flera exempel kan skapas i en körning under identiska förhållanden. Därför kan materialförstörande tester utföras på proverna med fördelen att de har (nästan) identiska kvar för att bygga den faktiska ventilen. Införandet av utskriftsfilerna som kompletterande filer i denna studie är tänkt att stödja utvecklingen av flerskiktade hjärtklaffsställningar. Denna nya elektrospinningsteknik har också en hög potential för andra områden inom regenerativ medicin, eftersom modifierade samlare och andra 3D-tryckta, snurrande mallar är lätta att implementera.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), finansierat av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), projektnummer MA 2186/14-1.
BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
PLA | Ultimaker BV | PLA | |
Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma – Aldrich | S 7635 | Texas Red |
Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |