Заживление ран роговицы рыбок данио: от истирания до анализа закрытия раны

Summary

Этот протокол фокусируется на повреждении глазной поверхности рыбок данио путем истирания для оценки последующего закрытия раны на клеточном уровне. Этот подход использует глазной заусенец для частичного удаления эпителия роговицы и использует сканирующую электронную микроскопию для отслеживания изменений в морфологии клеток во время закрытия раны.

Abstract

Как прозрачная поверхность глаза, роговица играет важную роль в ясном зрении. Благодаря своему расположению эта ткань склонна к экологическим нарушениям. Действительно, травмы глаз, наиболее часто встречающиеся клинически, – это травмы роговицы. В то время как заживление ран роговицы широко изучалось у мелких млекопитающих (то есть мышей, крыс и кроликов), исследования физиологии роговицы пренебрегли другими видами, включая рыбок данио, несмотря на то, что рыбки данио являются классической исследовательской моделью.

В этом отчете описывается метод выполнения истирания роговицы на рыбках данио. Рана выполняется in vivo на обезболенных рыбах с помощью глазного заусенца. Этот метод позволяет воспроизвести эпителиальную рану, оставляя остальную часть глаза нетронутой. После истирания контролируется закрытие раны в течение 3 ч, после чего рана реэпителизируется. С помощью сканирующей электронной микроскопии с последующей обработкой изображений можно исследовать форму эпителиальных клеток и апикальные выступы для изучения различных этапов закрытия эпителиальной раны роговицы.

Характеристики модели рыбок данио позволяют изучать физиологию эпителиальной ткани и коллективное поведение эпителиальных клеток при оспаривании ткани. Кроме того, использование модели, лишенной влияния слезной пленки, может дать новые ответы относительно реакции роговицы на стресс. Наконец, эта модель также позволяет очертить клеточные и молекулярные события, участвующие в любой эпителиальной ткани, подвергшейся физической ране. Этот метод может быть применен для оценки эффективности препарата при доклинических испытаниях.

Introduction

Поскольку большинство эпителиев находятся в контакте с внешней средой, они склонны к физическим травмам, что делает их хорошо подходящими для изучения процессов заживления ран. Среди хорошо изученных тканей роговица является чрезвычайно полезной моделью в исследовании клеточных и молекулярных аспектов заживления ран. Как прозрачная внешняя поверхность, он обеспечивает физическую защиту глаза и является первым элементом, который фокусирует свет на сетчатке. Хотя структура и клеточный состав сетчатки различаются между видами¹, эти элементы роговицы, как правило, похожи во всех глазах камерного типа, независимо от вида.

Роговица состоит из трех основных слоев². Первым и самым внешним слоем является эпителий, который постоянно обновляется для обеспечения его прозрачности. Вторым слоем является строма, которая содержит рассеянные клетки, называемые кератоцитами, в толстом слое строго организованных коллагеновых волокон. Третьим и самым внутренним слоем является эндотелий, который позволяет диффузии питательных веществ и жидкостей из передней камеры во внешние слои. Эпителиальные и стромальные клетки взаимодействуют через факторы роста и цитокины³. Это взаимодействие подчеркивается быстрым апоптозом и последующей пролиферацией кератоцитов после повреждения эпителия ^4,5. В случае более глубокой раны, такой как пункция, кератоциты принимают активное участие в процессе заживления⁶.

Находясь в контакте с внешней средой, распространены физические травмы роговицы. Многие из них вызваны мелкими посторонними предметами⁷, такими как песок или пыль. Рефлекс трения глаз может привести к обширным эпителиальным ссадинам и ремоделированию^{роговицы 8}. В зависимости от размера и глубины раны эти физические травмы болезненны и занимают несколько дней, чтобы зажить⁹. Оптимальные характеристики заживления ран модели облегчают понимание клеточных и молекулярных аспектов закрытия раны. Кроме того, такие модели также оказались полезными для тестирования новых молекул с потенциалом для ускорения заживления роговицы, как ранее было продемонстрировано^10,11.

Протокол, описанный здесь, направлен на использование рыбок данио в качестве соответствующей модели для изучения физического повреждения роговицы. Эта модель очень удобна для фармакологических скрининговых исследований, поскольку она позволяет добавлять молекулы непосредственно в воду резервуара и, следовательно, вступать в контакт с целебной роговицей. Подробности, представленные здесь, помогут ученым провести свои исследования на модели рыбок данио. Травма in vivo выполняется с притупленным глазным заусенцем. Воздействие на эпителиальные клетки, прилегающие или находящиеся на расстоянии от него, можно проанализировать путем специфического удаления центрального эпителия роговицы. В последние годы многочисленные доклады были посвящены такому методу на роговице грызунов 12,13,14,15,16,17; однако на сегодняшний день только в одном докладе этот метод применялся к рыбкам данио¹⁸.

Из-за своей простоты физическая рана полезна для очерчивания роли эпителиальных клеток в закрытии раны. Другой устоявшейся моделью повреждения роговицы является химический ожог, особенно щелочной ожог 19,20,21. Однако такой подход косвенно повреждает всю поверхность глаза, включая периферическую роговицу и строму роговицы¹⁹. Действительно, щелочные ожоги потенциально вызывают язвы роговицы, перфорации, помутнение эпителия и быструю неоваскуляризацию²², а неконтролируемый исход щелочных ожогов дисквалифицирует этот подход для общих исследований заживления ран. Многочисленные другие методы также используются для исследования заживления ран роговицы в соответствии с конкретным направлением рассматриваемого исследования (например, полная эпителиальная санация²³, сочетание химического и механического повреждения раны частичной толщины²⁴, эксимерная лазерная абляция для ран, простирающихся до стромы²⁵). Использование глазного заусенца ограничивает фокусную точку эпителиальной реакцией на рану и обеспечивает высокую воспроизводимость раны.

Как и при каждом способе нанесения раны, использование глазного заусенца имеет свои преимущества и недостатки. Основным недостатком является то, что реакция в основном эпителиальная, она не полностью отражает ссадины, наблюдаемые в клинических условиях. Тем не менее, этот метод имеет множество преимуществ, в том числе легкость, с которой он может быть настроен и выполнен, его точность, его воспроизводимость и тот факт, что он неинвазивный, что делает его методом, хорошо переносимым животными.

Protocol

Все эксперименты были одобрены национальным советом по экспериментам на животных. 1. Препараты Подготовьте раствор трицина, используемый для анестезии26 заранее (0,4% раствор, используемый в этом протоколе). Используйте перчатки и храните матери…

Representative Results

Это исследование описывает метод с использованием офтальмологического заусенца в экспериментах по заживлению ран роговицы рыбок данио. Метод модифицирован по сравнению с предыдущими исследованиями на мышах, где было показано, что заусенец эффективно удаляет эпителиальные клеточные…

Discussion

Физические травмы роговицы являются наиболее распространенной причиной визитов пациентов офтальмологии в больницу. Поэтому важно установить соответствующие модели для изучения различных аспектов патофизиологии роговицы. До сих пор мышь является наиболее часто используемой модель?…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica