ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒:擦過傷から創傷閉鎖画像分析まで

Summary

このプロトコルは、細胞レベルでのその後の創傷閉鎖を評価するために、擦過傷によってゼブラフィッシュの眼表面を損傷することに焦点を当てている。このアプローチは、眼のバリを利用して角膜上皮を部分的に除去し、走査型電子顕微鏡を使用して創傷閉鎖中の細胞形態の変化を追跡する。

Abstract

目の透明な表面として、角膜は明確な視力のために役立ちます。その場所のために、この組織は環境侮辱を受けやすいです。実際、臨床的に最も頻繁に遭遇する眼の損傷は、角膜に対するものである。角膜創傷治癒は小型哺乳類(すなわち、マウス、ラット、ウサギ)で広く研究されてきたが、ゼブラフィッシュは古典的な研究モデルであるにもかかわらず、角膜生理学研究はゼブラフィッシュを含む他の種を無視してきた。

この報告は、ゼブラフィッシュに角膜擦過傷を行う方法について記載する。創傷は、眼のバリを用いて麻酔をかけた魚に インビボで 行われる。この方法は、再現性のある上皮創傷を可能にし、眼の残りの部分を無傷のままにする。擦過傷後、創傷閉鎖を3時間にわたって監視し、その後、創傷を再上皮化する。走査型電子顕微鏡法を用いて、続いて画像処理することにより、上皮細胞形状、および頂端突起を調査して、角膜上皮創傷閉鎖中の様々なステップを研究することができる。

ゼブラフィッシュモデルの特徴は、上皮組織の生理機能および組織が挑戦されたときの上皮細胞の集団的挙動の研究を可能にする。さらに、涙液膜の影響を奪われたモデルの使用は、ストレスに対する角膜応答に関する新しい答えを生み出すことができる。最後に、このモデルはまた、物理的創傷に供される任意の上皮組織に関与する細胞および分子事象の描写を可能にする。この方法は、前臨床試験における薬剤有効性の評価に適用することができる。

Introduction

上皮のほとんどは外部環境と接触しているため、身体的な損傷を受けやすく、創傷治癒プロセスの研究に適しています。よく研究された組織の中で、角膜は創傷治癒の細胞的および分子的側面の調査において非常に有用なモデルである。透明な外面として、それは目に物理的な保護を提供し、網膜に光を集中させる最初の要素です。網膜の構造と細胞組成は種¹によって異なるが、角膜のこれらの要素は、種に関係なく、すべてのカメラタイプの目で一般的に類似している。

角膜は、3つの主要な層²から構成される。最初で最外層は上皮であり、その透明性を確保するために絶えず更新されています。第2の層は間質であり、厳密に組織化されたコラーゲン線維の厚い層内に、角化細胞と呼ばれる散在細胞を含む。第3および最内層は内皮であり、これは前房から外層への栄養素および液体拡散を可能にする。上皮細胞と間質細胞は、成長因子とサイトカインを介して相互作用^する3。この相互作用は、上皮損傷後の急速なアポトーシスおよびその後の角化細胞の増殖によって強調される^4,5。穿刺などのより深い創傷の場合、角化細胞は治癒過程⁶において積極的な役割を果たす。

外部環境と接触しているため、角膜の身体的傷害が一般的です。それらの多くは、砂やほこりなどの小さな異物⁷によって引き起こされます。眼の擦れの反射は、広範な上皮擦過傷および角膜リモデリングにつながる可能性がある⁸。創傷の大きさと深さに応じて、これらの身体的傷害は痛みを伴い、治癒に数日かかる⁹。モデルの最適な創傷治癒特性は、創傷閉鎖の細胞的および分子的側面の理解を容易にする。さらに、このようなモデルは、以前に実証したように、角膜治癒を促進する可能性のある新しい分子の試験にも有用であることが証明されている^10,11。

ここで説明するプロトコルは、角膜の物理的損傷を研究するための関連モデルとしてゼブラフィッシュを使用することを目的としています。このモデルは、分子をタンク水に直接添加し、治癒角膜と接触させることができるため、薬理学的スクリーニング研究に非常に便利です。ここで提供される詳細は、科学者がゼブラフィッシュモデルに関する研究を行うのに役立ちます。インビボ傷害は、鈍い眼のバリで行われる。隣接する、またはそれから離れている上皮細胞への影響は、角膜上皮の中心を特異的に除去することによって分析することができる。近年、げっ歯類角膜に関するこのような方法に焦点を当てた多数の報告12、¹³、¹⁴、^15、16、17;しかし、今日まで、この方法をゼブラフィッシュ18に適用した報告は^1つだけです。

その単純さのために、物理的創傷は、創傷閉鎖における上皮細胞の役割を描写するのに有用である。角膜損傷の別の十分に確立されたモデルは、化学火傷、特にアルカリ火傷¹⁹、^20、21である。しかしながら、このようなアプローチは、末梢角膜および角膜間質¹⁹を含む眼表面全体を間接的に損傷する。実際、アルカリ火傷は角膜潰瘍、穿孔、上皮不透明化、および迅速な新生血管形成を誘発する可能性があり²²、アルカリ火傷の制御不能な結果は、一般的な創傷治癒研究のためのそのアプローチを失格にする。多数の他の方法もまた、問題となっている研究の特定の焦点に従って角膜創傷治癒を調査するために使用される(例えば、完全な上皮デブリードマン²³、部分厚創傷24に対する化学的および機械的損傷の組み合わせ、間質²⁵に延びる創傷に対するエキシマレーザーアブレーション)。眼バリの使用は、焦点を創傷に対する上皮反応に制限し、再現性の高い創傷を提供する。

創傷を与える各方法と同様に、眼垢の使用には長所と短所がある。主な欠点は、応答が主に上皮的であり、臨床現場で見られる擦過傷を完全に反映していないことである。しかし、この方法には、セットアップと実行の容易さ、その精度、再現性、および非侵襲的であるという事実など、多くの利点があり、動物によって十分に許容される方法となっています。

Protocol

すべての実験は、国家動物実験委員会によって承認された。 1. 準備 麻酔26 に用いるトリカイン原液を予め用意しておく(このプロトコールで用いる0.4%原液)。手袋を着用し、可能な限り材料をヒュームフードに入れてください。 50 mLの0.4%溶液の場合、200 mgのトリカイン粉末を50 mLチューブに秤量する。粉末を約45mLの二重蒸留水?…

Representative Results

この研究は、ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒実験において眼科バリを用いる方法を記載する。この方法は、バリが上皮細胞層を効率的に除去することが示されたマウスに関する以前の研究から改変された13。ゼブラフィッシュの角膜創傷における課題には、眼のサイズが比較的小さいこと、および時間のかかる実験の場合、えらを通る一定の水流を維持する必要性が含まれ?…

Discussion

角膜の身体的傷害は、眼科患者が病院を訪れる最も一般的な原因である。したがって、角膜病態生理学のさまざまな側面の研究に関連するモデルを確立することが重要です。これまでのところ、マウスは角膜創傷治癒の研究に最も一般的に使用されるモデルである。しかし、角膜創傷治癒に対する特定の薬物の影響を検証するために、マウスの創傷眼に点眼剤を添加することは困難な場合が?…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica