Global nivå kvantifisering av Histone post-oversettelsesendringer i en 3D-cellekulturmodell av levervev
Summary
Denne protokollen skisserer hvordan et tredimensjonalt cellekultursystem kan brukes til å modellere, behandle og analysere kromatinmodifikasjoner i en nesten fysiologisk tilstand.
Abstract
Flate kulturer av pattedyrceller er en mye brukt in vitro tilnærming for å forstå cellefysiologi, men dette systemet er begrenset i modellering av faste vev på grunn av unaturlig rask cellereplikering. Dette er spesielt utfordrende når modellering av moden kromatin, da raske replikeringsceller ofte er involvert i DNA-replikasjon og har en heterogen polyploid populasjon. Presentert nedenfor er en arbeidsflyt for modellering, behandling og analyse av quiescent kromatin modifikasjoner ved hjelp av en tredimensjonal (3D) cellekultur system. Ved hjelp av denne protokollen vokser hepatocellulære karsinomcellelinjer som reproduserbare 3D-sfæroider i en inkubator som gir aktiv næringsdiffusjon og lave skjærekrefter. Behandling med natrium butyrat og natrium succinate induserte en økning i henholdsvis histonacetylering og kortfattethet. Økning i nivåer av histon acetylering og kortfattethet er forbundet med en mer åpen kromatintilstand. Sfæroider samles deretter inn for isolering av cellekjerner, hvorfra histoneproteiner ekstraheres for analyse av deres postoversettelsesendringer. Histone analyse utføres via flytende kromatografi koblet online med tandem masse spektrometri, etterfulgt av en intern beregningsrørledning. Til slutt vises eksempler på datarepresentasjon for å undersøke frekvensen og forekomsten av kombinatoriske histonemerker.
Introduction
Siden slutten av 1800-tallet har cellekultursystemer blitt brukt som modell for å studere vekst og utvikling av celler utenfor menneskekroppen 1,2. Deres bruk har også blitt utvidet for å studere hvordan vev og organer fungerer i både sunne og syke sammenhenger 1,3. Suspensjonsceller (f.eks. blodceller) vokser i Petri-retter eller kolber sømløst og om hverandre, da de ikke samles i tredimensjonale (3D) strukturer in vivo. Celler avledet fra faste organer kan vokse i enten todimensjonale (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i en monolayer som holder seg til en flat overflate 2,4. 2D-cellekultursystemer er preget av eksponentiell vekst og en rask doblingstid, vanligvis 24 timer til noen dager5. Celler i 3D-systemer vokser for å danne intrikate cellecelleinteraksjoner som modellerer vevlignende konglomerater nærmere, og de er preget av deres evne til å nå en dynamisk likevekt der deres doblingstid kan nå 1 måned eller lenger5.
Presentert i dette dokumentet er en innovativ metodikk for å vokse 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer som simulerer redusert tyngdekraft6. Dette er et forenklet derivat av et cellekultursystem introdusert av NASA på 1990-tallet7. Denne tilnærmingen minimerer skjærekrefter, som forekommer i eksisterende metoder som spinnende kolber, og øker sfæroid reproduserbarhet6. I tillegg øker den roterende bioreaktoren aktiv næringsdiffusjon, og minimerer nekrotisk formasjon som forekommer i systemer som hengende dråpecellekultur der medieutveksling er upraktisk6. På denne måten vokser cellene for det meste uforstyrret, noe som muliggjør dannelse av strukturelle og fysiologiske egenskaper forbundet med celler som vokser i vev. C3A hepatocytter (HepG2/C3A) dyrket på denne måten hadde ikke bare ultrastrukturelle organeller, men produserte også mengder ATP, adenylatkinase, urea og kolesterol som kan sammenlignes med nivåer observert i vivo 1,2. I tillegg viser celler som vokser i 2D vs.3D cellekultursystemer forskjellige genuttrykksmønstre8. Genuttrykksanalyse av C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste at disse cellene uttrykte et bredt spekter av leverspesifikke proteiner, samt gener involvert i viktige veier som regulerer leverfunksjonen8. Tidligere publikasjoner viste forskjellene mellom proteomer av eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk likevekt i 3D-sfæroidkulturer5. Disse forskjellene inkluderer cellulær metabolisme, som igjen påvirker strukturen, funksjonen og fysiologien til cellen5. Proteomet av celler dyrket i 2D-kultur var mer beriket i proteiner involvert i cellereplikering, mens proteomet av 3D-sfæroider var mer beriket i leverfunksjonalitet5.
Den langsommere replikeringshastigheten til celler som vokser som 3D-sfæroider, modellerer mer nøyaktig spesifikke fenomener forbundet med kromatintilstand og modifikasjoner (f.eks. histoneklipping9). Histone klipping er en irreversibel histone post-translasjonell modifikasjon (PTM) som forårsaker proteolytisk spalting av en del av histone N-terminal halen. Mens den biologiske funksjonen fortsatt er under diskusjon 10,11,12,13, er det klart at dens tilstedeværelse i primære celler og levervev er modellert av HepG2 / C3A celler vokst som sfæroider, men ikke som flate celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikasjoner regulerer DNA-avlesning hovedsakelig ved å modulere tilgjengelighet til gener og dermed deres uttrykk14. Histone PTMer påvirker enten kromatintilstanden direkte ved å påvirke nettoladningen til nukleosomene der histoner er samlet, eller indirekte ved å rekruttere kromatinforfattere, lesere og viskelær14. Hundrevis av histone PTMer har blitt identifisert til dags dato15, forsterke hypotesen om at kromatin er vert for en “histone kode” som brukes av cellen til å tolke DNA16. Imidlertid er identifiseringen av et utall PTM-kombinasjoner15, og oppdagelsen av at kombinasjoner av histone PTMer ofte har forskjellige biologiske funksjoner fra PTMer tilstede isolert (f.eks. Fischle, et al.17), fremhever at det kreves mer arbeid for å dekryptere “histonekoden”.
For tiden er histone PTM-analyse enten basert på teknikker som bruker antistoffer (f.eks. vestlige flekker, immunfluorescens eller kromatinimoprecipitation etterfulgt av sekvensering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistoffbaserte teknikker har høy følsomhet og kan gi detaljert informasjon om genom-bred lokalisering av histone merker, men er ofte begrenset i å studere sjeldne PTMer eller PTMer til stede i kombinasjoner 18,19,20. MS er mer egnet for høy gjennomstrømning og objektiv identifisering og kvantifisering av enkelt- og sameksisterte proteinmodifikasjoner, spesielt histoneproteiner 18,19,20. Av disse grunnene har dette og flere andre laboratorier optimalisert MS-rørledningen for analyse av histonepeptider (bottom-up MS), intakte histonehaler (middels ned MS) og histoneproteiner i full lengde (ovenfra og ned MS)21,22,23.
Nedenfor er en arbeidsflyt for dyrking av HepG2/C3A-sfæroider og klargjøring av dem for histonepeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-flytende kromatografi, kombinert online med tandemmassespektrometri (nLC-MS/MS). En 2D-cellekultur ble dyrket og cellene ble høstet og overført til en bioreaktor hvor de skulle begynne å danne sfæroider (figur 1). Etter 18 dager i kultur ble sfæroider behandlet med natrium butyrat eller natrium succinate for å øke de relative overflodene av histonacetylering og kortfattethet. Spesielt kan 3D-kulturer behandles med gentoksiske forbindelser like godt som deres flate kulturekvivalenter; Faktisk fremhever nyere publikasjoner at toksikologiresponsen til celler i 3D-kultur er mer lik primærvev enn de i 2D flat kultur24,25. Celler ble deretter samlet inn på bestemte tidspunkter og kjernefysisk isolasjon ble utført. Deretter ble histoner ekstrahert og avlet med propionisk anhydrid før og etter trypsin fordøyelse i henhold til en protokoll først utviklet av Garcia et al.26. Denne prosedyren genererer peptider av riktig størrelse for online separasjon med omvendt fasekromatografi (C18) og deteksjon med MS. Til slutt ble histonepeptider identifisert og kvantifisert, og de genererte dataene var representert på flere måter for en mer fullstendig biologisk tolkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen av histone PTMer er fundamentalt forskjellig fra den typiske proteomiske analyserørledningen. De fleste histone PTMs har fortsatt gåtefulle biologiske funksjoner; Som et resultat er merknader som Gene Ontology eller pathway-databaser ikke tilgjengelige. Det finnes flere ressurser som forbinder histone modifikasjoner med enzymet som er ansvarlig for deres katalyse eller proteiner som inneholder domener som binder disse PTM-ene (f.eks. HISTome36). I tillegg er det mulig å spekulere på d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sidoli-laboratoriet anerkjenner takknemlig Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
Referências
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
- Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
- Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
- Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
- Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
- Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
- Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
- Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
- Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
- Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
- Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
- Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
- Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
- Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
- Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
- Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
- Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
- Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
- Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
- Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
- Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
- Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
- Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
- Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).
