Анализ динамики фекальной микробиоты у мышей, склонных к волчанке, с использованием простого, экономически эффективного метода выделения ДНК
Summary
Этот протокол обеспечивает простой, экономически эффективный метод выделения ДНК для анализа изменений микробиоты кишечника мышей во время развития аутоиммунного заболевания.
Abstract
Микробиота кишечника играет важную роль в обучении иммунной системы. Эта взаимосвязь чрезвычайно важна для понимания аутоиммунных заболеваний, которые обусловлены не только генетическими факторами, но и факторами окружающей среды, которые могут вызвать начало и / или ухудшить течение заболевания. Ранее опубликованное исследование динамики кишечной микробиоты у самок мышей, склонных к волчанке, показало, как изменения микробиоты кишечника могут изменить прогрессирование заболевания. Здесь описан протокол извлечения репрезентативных образцов из микробиоты кишечника для исследований аутоиммунитета. Образцы микробиоты собирают из ануса и обрабатывают, из которого извлекают ДНК с помощью фенол-хлороформного метода и очищают спиртовым осаждением. После проведения ПЦР очищенные ампликоны секвенируются с помощью платформы секвенирования следующего поколения в Аргоннской национальной лаборатории. Наконец, анализируются данные секвенирования гена рибосомальной РНК 16S. В качестве примера показаны данные, полученные из сравнений кишечной микробиоты мышей MRL/lpr с CX3CR1 или без него. Результаты показали значительные различия в родах, содержащих патогенные бактерии, такие как в типе Proteobacteria, а также в роде Bifidobacterium, который считается частью здоровой комменсальной микробиоты. Таким образом, этот простой, экономически эффективный метод выделения ДНК является надежным и может помочь в исследовании изменений микробиоты кишечника, связанных с аутоиммунными заболеваниями.
Introduction
Люди и бактерии сосуществуют уже давно. Они установили созависимую связь с взаимовыгодными эффектами, которая влияет на иммунные реакции хозяина количественными и качественными способами1. Недавние исследования предполагают связь между составом микробиоты кишечника и патогенезом аутоиммунных заболеваний, которые включают рассеянный склероз2, ревматоидный артрит3, диабет 2 типа4, воспалительное заболевание кишечника5 и системную красную волчанку (СКВ)6. Однако является ли микробиота кишечника основной причиной или вторичным эффектом этих аутоиммунных заболеваний, до сих пор неясно7. Потенциально микробиота кишечника может усугубить заболевание во время эффекторной фазы аутоиммунных расстройств или играть роль в регулировании индукции этих заболеваний8.
Сообщалось о дисбактериозе кишечника у самок мышей MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr), а изменения микробиоты кишечника со значительным истощением лактобактерий наблюдались9. Когда смесь из пяти штаммов Lactobacillus вводилась перорально, симптомы, подобные волчанке, были в значительной степени ослаблены у этих мышей, что свидетельствует о существенной роли микробиоты в регулировании патогенеза СКВ.
Следующая методика экстракции ДНК позволяет отслеживать колебания микробиоты и анализировать их качественно и количественно при течении мышиной СКВ-подобной болезни у склонных к волчанке мышей. Независимо от того, следует ли исследовать здоровую микробиоту кишечника или определить дисбактериоз, важно критически изучить, как собираются данные и являются ли они точными и воспроизводимыми10. Каждый шаг имеет решающее значение в этом процессе. Для извлечения микробной ДНК необходимо использовать соответствующую методологию, поскольку любая возможная проблема, приводящая к смещениям в процессе экстракции ДНК, может привести к неточному микробному представлению. Хотя фенол-хлороформный метод описан здесь, существуют коммерчески доступные наборы для извлечения ДНК из бактерий, которые хорошо работают в конкретных случаях11. Однако их удобство использования ограничено стоимостью и необходимым количеством образцов.
Протокол, представленный здесь, является экономически эффективным и требует лишь небольшого количества выборки. Он отлично работает с любым типом образца стула и полезен для изучения динамики микробиоты кишечника с течением времени, а также для сравнения между группами. ДНК выделяют методом очистки спирта, в котором используют фенол, хлороформ и изоамиловый спирт. Экстракция на спиртовой основе помогает очистить и удалить образец белков и липидов, где ДНК выпадает в осадок на заключительном этапе. Предложенный метод обладает значительно высокой эффективностью и качеством и доказал свою точность при выявлении бактериальных популяций. Одним из критических замечаний во время процедуры является то, что может произойти загрязнение ДНК, и, таким образом, требуется соответствующая обработка образцов12.
Затем ДНК анализируется платформами секвенирования следующего поколения для гена 16S рРНК, такими как Illumina MiSeq. В частности, гипервариабельная область V4 анализируется для обеспечения лучшей количественной оценки для высокоранговых таксонов13. Последующий анализ биоинформатики передается на аутсорсинг, за которым следует внутренний анализ с использованием стандартных статистических методов. Существует множество программ биоинформатики с открытым исходным кодом, доступных для последующего секвенирования, и тип выполняемых анализов в значительной степени зависит от конкретного биологического вопроса, представляющего интерес14. Этот протокол фокусируется конкретно на экспериментальных этапах до секвенирования и обеспечивает более универсальный, экономически эффективный, сопоставимый и эффективный метод получения ДНК из образцов фекалий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сбалансированная микробиота кишечника может защитить организм человека от заболеваний. Как только этот баланс нарушается внешними или внутренними триггерами, последствия могут быть разрушительными. Этот метод представляет собой способ анализа динамики кишечной микробиоты в мышины?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы ценим помощь Аргоннской национальной лаборатории и наших сотрудничающих биоинформатиков. Эта работа поддерживается различными NIH и внутренними грантами.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
Referências
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota – effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
