Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN
Summary
Ce protocole fournit une méthode d’isolement de l’ADN simple et rentable pour l’analyse des altérations du microbiote intestinal murin au cours du développement de maladies auto-immunes.
Abstract
Le microbiote intestinal joue un rôle important dans l’éducation du système immunitaire. Cette relation est extrêmement importante pour comprendre les maladies auto-immunes qui ne sont pas seulement motivées par des facteurs génétiques, mais aussi par des facteurs environnementaux qui peuvent déclencher l’apparition et / ou aggraver l’évolution de la maladie. Une étude publiée précédemment sur la dynamique du microbiote intestinal chez les souris femelles LMR/LPR sujettes au lupus a montré comment les changements du microbiote intestinal peuvent modifier la progression de la maladie. Ici, un protocole est décrit pour extraire des échantillons représentatifs du microbiote intestinal pour des études d’auto-immunité. Des échantillons de microbiote sont prélevés dans l’anus et traités, à partir desquels l’ADN est extrait selon une méthode phénol-chloroforme et purifié par précipitation alcoolique. Une fois la PCR effectuée, les amplicons purifiés sont séquencés à l’aide d’une plate-forme de séquençage de nouvelle génération au laboratoire national d’Argonne. Enfin, les données de séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S sont analysées. À titre d’exemple, les données obtenues à partir de comparaisons du microbiote intestinal de souris LMR/LPR avec ou sans CX3CR1 sont présentées. Les résultats ont montré des différences significatives dans les genres contenant des bactéries pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria, ainsi que du genre Bifidobacterium, qui est considéré comme faisant partie du microbiote commensale sain. En résumé, cette méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN est fiable et peut aider à étudier les changements du microbiote intestinal associés aux maladies auto-immunes.
Introduction
Les humains et les bactéries coexistent depuis longtemps. Ils ont établi une relation de codépendance avec des effets bénéfiques mutuels qui influencent les réponses immunitaires de l’hôte de manière quantitative et qualitative1. Des études récentes suggèrent une association entre la composition du microbiote intestinal et la pathogenèse des maladies auto-immunes qui comprennent la sclérose en plaques 2, la polyarthrite rhumatoïde3, le diabète de type2 4, la maladie inflammatoire de l’intestin5 et le lupus érythémateux disséminé (LED)6. Cependant, on ne sait toujours pas si le microbiote intestinal est la cause principale ou un effet secondaire de ces maladies auto-immunes7. Potentiellement, le microbiote intestinal pourrait exacerber la maladie pendant la phase effectrice des maladies auto-immunes ou jouer un rôle dans la régulation de l’induction de ces maladies8.
Une dysbiose intestinale a été rapportée chez des souris femelles MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr) sujettes au lupus, et des modifications du microbiote intestinal avec une déplétion significative des lactobacilles ont été observées9. Lorsqu’un mélange de cinq souches de Lactobacillus a été administré par voie orale, les symptômes de type lupus ont été largement atténués chez ces souris, suggérant un rôle essentiel du microbiote dans la régulation de la pathogenèse du LED.
La technique suivante d’extraction d’ADN permet de suivre les fluctuations du microbiote et de les analyser qualitativement et quantitativement au cours de l’évolution de la maladie de type LED murin chez les souris sujettes au lupus. Qu’il s’agisse d’examiner le microbiote intestinal sain ou de définir la dysbiose, il est important d’examiner de manière critique comment les données sont collectées et si elles sont exactes et reproductibles10. Chaque étape est essentielle dans ce processus. Une méthodologie appropriée doit être utilisée pour extraire l’ADN microbien, car tout problème éventuel introduisant des biais pendant le processus d’extraction de l’ADN pourrait entraîner une représentation microbienne inexacte. Bien que la méthode phénol-chloroforme soit décrite ici, il existe des kits disponibles dans le commerce pour extraire l’ADN de bactéries qui fonctionnent bien dans des cas particuliers11. Cependant, leur facilité d’utilisation est limitée par le coût et la quantité d’échantillon requise.
Le protocole présenté ici est rentable et ne nécessite qu’une petite quantité d’échantillon. Il fonctionne bien avec n’importe quel type d’échantillon de selles et est utile pour étudier la dynamique du microbiote intestinal au fil du temps ainsi que les comparaisons entre les groupes. L’ADN est isolé avec une méthode de purification de l’alcool, qui utilise du phénol, du chloroforme et de l’alcool isoamylique. L’extraction à base d’alcool aide à nettoyer et à éliminer l’échantillon de protéines et de lipides, où l’ADN est précipité à l’étape finale. La méthode proposée a une efficacité et une qualité significativement élevées et s’est avérée précise dans l’identification des populations bactériennes. Une remarque critique au cours de la procédure est que la contamination de l’ADN peut se produire, et donc une manipulation appropriée des échantillons est nécessaire12.
L’ADN est ensuite analysé par les plateformes de séquençage de nouvelle génération pour le gène de l’ARNr 16S, tel que l’Illumina MiSeq. En particulier, la région hyper-variable V4 est analysée pour fournir une meilleure quantification pour les taxons de rangélevé 13. L’analyse bioinformatique ultérieure est externalisée, suivie d’une analyse interne utilisant des méthodes statistiques standard. Il existe de nombreux logiciels bioinformatiques open source disponibles pour le séquençage en aval, et le type d’analyses effectuées dépend fortement de la question biologique spécifique d’intérêt14. Ce protocole se concentre spécifiquement sur les étapes expérimentales précédant le séquençage et fournit une méthode plus polyvalente, rentable, comparable et efficace pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un microbiote intestinal équilibré peut protéger le corps humain contre les maladies. Une fois que cet équilibre est perturbé par des déclencheurs externes ou internes, les conséquences peuvent être dévastatrices. Cette méthode présente un moyen d’analyser la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins. La méthode convient non seulement aux comparaisons entre groupes, mais aussi au suivi du microbiote intestinal au fil du temps afin de mieux identifier les facteurs dépendants du temps qui p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions l’aide du laboratoire national d’Argonne et de nos bioinformaticiens collaborateurs. Ce travail est soutenu par diverses subventions internes et NIH.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
Referências
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