간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석
Summary
이 프로토콜은 자가면역 질환 발병 중 쥐 장내 미생물 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다.
Abstract
장내 미생물총은 면역 체계를 교육하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 관계는 유전적 요인뿐만 아니라 발병을 유발하거나 질병 경과를 악화시킬 수 있는 환경적 요인에 의해 유발되는 자가면역 질환을 이해하는 데 매우 중요합니다. 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL/lpr 암컷 마우스에서 장내 미생물총의 역학에 대해 이전에 발표된 연구는 장내 미생물총의 변화가 질병 진행을 어떻게 변화시킬 수 있는지 보여주었습니다. 여기서는자가 면역 연구를 위해 장내 미생물 총에서 대표 샘플을 추출하기위한 프로토콜이 설명됩니다. 미생물 총을 항문에서 채취하여 처리하고, 페놀 – 클로로포름 방법을 사용하여 DNA를 추출하고 알코올 침전으로 정제합니다. PCR이 수행된 후, 정제된 앰플리콘은 아르곤 국립 연구소의 차세대 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 마지막으로 16S 리보솜 RNA 유전자 시퀀싱 데이터를 분석합니다. 예를 들어, CX3CR1이 있거나없는 MRL / lpr 마우스의 장내 미생물 비교에서 얻은 데이터가 표시됩니다. 결과는 프로테오박테리아 문과 같은 병원성 박테리아를 포함하는 속과 건강한 공생 미생물총의 일부로 간주되는 비피도박테리움 속에서 상당한 차이를 보여주었습니다. 요약하면, 이 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법은 신뢰할 수 있으며 자가면역 질환과 관련된 장내 미생물 변화를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
인간과 박테리아는 오랫동안 공존해 왔습니다. 그들은 양적 및 질적 방식으로 숙주 면역 반응에 영향을 미치는 상호 유익한 효과와 상호 의존적 관계를 확립했습니다1. 최근 연구에 따르면 장내 미생물총과 다발성 경화증 2, 류마티스 관절염3, 제2형 당뇨병4, 염증성 장 질환5 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)6를 포함하는 자가면역 질환의 발병기전이 연관되어 있습니다. 그러나 장내 미생물이 이러한자가 면역 질환의 주요 원인인지 또는 2 차 효과인지는 여전히 불분명합니다7. 잠재적으로, 장내 미생물총은 자가면역 질환의 이펙터 단계에서 질병을 악화시키거나이러한 질병의 유도를 조절하는 역할을 할 수 있다8.
암컷 루푸스 경향이 있는 MRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr) 마우스에서 장내 dysbiosis가 보고되었으며, 락토바실러스의 상당한 고갈과 함께 장내 미생물총의변화가 관찰되었습니다9. 5 가지 락토 바실러스 균주의 혼합물을 경구 투여했을 때,이 마우스에서 루푸스와 유사한 증상이 크게 약화되어 SLE 병인을 조절하는 데 미생물 총의 필수적인 역할을 시사합니다.
다음의 DNA 추출 기술은 루푸스 경향이있는 마우스에서 쥐 SLE와 유사한 질병의 과정에서 미생물 변동을 추적하고 정 성적 및 정량적으로 분석 할 수있게합니다. 건강한 장내 미생물을 검사하든 dysbiosis를 정의하든 데이터 수집 방법과 정확하고 재현 가능한지 비판적으로 조사하는 것이 중요합니다10. 이 과정에서 모든 단계가 중요합니다. DNA 추출 과정에서 편향을 도입할 수 있는 문제가 있으면 부정확한 미생물 표현이 발생할 수 있으므로 미생물 DNA를 추출하려면 적절한 방법론을 사용해야 합니다. 페놀-클로로포름 방법이 여기에 설명되어 있지만, 특정 경우에 잘 작동하는 박테리아로부터 DNA를 추출하는 시판되는 키트가 있습니다11. 그러나 유용성은 비용과 필요한 샘플 수량에 의해 제한됩니다.
여기에 제시된 프로토콜은 비용 효율적이며 소량의 샘플 만 필요합니다. 모든 종류의 대변 샘플에서 잘 작동하며 시간이 지남에 따라 장내 미생물의 역학과 그룹 간의 비교를 연구하는 데 유용합니다. DNA는 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올을 사용하는 알코올 정제 방법으로 분리됩니다. 알코올 기반 추출은 최종 단계에서 DNA가 침전되는 단백질 및 지질 샘플을 세척하고 제거하는 데 도움이 됩니다. 제안 된 방법은 상당히 높은 효율성과 품질을 가지며 박테리아 개체군을 식별하는 데 정확한 것으로 입증되었습니다. 절차 중 한 가지 중요한 점은 DNA 오염이 발생할 수 있으므로 적절한 샘플 처리가 필요하다는 것입니다12.
그런 다음 DNA는 Illumina MiSeq와 같은 16S rRNA 유전자에 대한 차세대 시퀀싱 플랫폼에 의해 분석됩니다. 특히, V4 초가변 영역은 상위 순위 분류군(13)에 대한 더 나은 정량화를 제공하기 위해 분석된다. 후속 생물 정보학 분석은 아웃소싱되고 표준 통계 방법을 사용한 사내 분석이 이어집니다. 다운스트림 시퀀싱에 사용할 수 있는 수많은 오픈 소스 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 있으며 수행되는 분석 유형은 관심 있는 특정 생물학적 질문에 따라 크게 달라집니다14. 이 프로토콜은 특히 시퀀싱 이전의 실험 단계에 초점을 맞추고 분변 샘플에서 DNA를 얻기 위한 보다 다양하고 비용 효율적이며 비교 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
균형 잡힌 장내 미생물은 질병으로부터 인체를 보호 할 수 있습니다. 이 균형이 외부 또는 내부 트리거에 의해 중단되면 결과는 치명적일 수 있습니다. 이 방법은 쥐 모델에서 장내 미생물의 역학을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 그룹 간의 비교뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 장내 미생물총을 추적하여 장내 미생물총을 방해하는 시간 의존적 요인을 더 잘 식별하는 데에도 적합합니다….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
아르곤 국립 연구소와 협력하는 생물 정보학자의 도움에 감사드립니다. 이 작업은 다양한 NIH 및 내부 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
Referências
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