Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico
Summary
Este protocolo fornece um método de isolamento de DNA simples e econômico para a análise de alterações da microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes.
Abstract
A microbiota intestinal tem um papel importante na educação do sistema imunológico. Essa relação é extremamente importante para a compreensão de doenças autoimunes que não são apenas impulsionadas por fatores genéticos, mas também por fatores ambientais que podem desencadear o início e/ou piorar o curso da doença. Um estudo publicado anteriormente sobre a dinâmica da microbiota intestinal em camundongos fêmeas MRL/lpr propensas ao lúpus mostrou como as mudanças da microbiota intestinal podem alterar a progressão da doença. Aqui, um protocolo é descrito para extrair amostras representativas da microbiota intestinal para estudos de autoimunidade. Amostras de microbiota são coletadas do ânus e processadas, das quais o DNA é extraído usando um método fenol-clorofórmio e purificado por precipitação de álcool. Após a execução da PCR, os amplificadores purificados são sequenciados usando uma plataforma de sequenciamento de próxima geração no Argonne National Laboratory. Finalmente, os dados de sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S são analisados. Como exemplo, são mostrados dados obtidos a partir de comparações da microbiota intestinal de camundongos MRL/lpr com ou sem CX3CR1. Os resultados mostraram diferenças significativas em gêneros contendo bactérias patogênicas, como as do filo Proteobacteria, bem como do gênero Bifidobacterium, que é considerado parte da microbiota comensal saudável. Em resumo, este método de isolamento de DNA simples e econômico é confiável e pode ajudar na investigação de alterações da microbiota intestinal associadas a doenças autoimunes.
Introduction
Humanos e bactérias coexistem há muito tempo. Eles estabeleceram uma relação codependente com efeitos benéficos mútuos que influencia as respostas imunes do hospedeiro de forma quantitativa e qualitativa1. Estudos recentes sugerem uma associação entre a composição da microbiota intestinal e a patogênese de doenças autoimunes que incluem esclerose múltipla 2, artrite reumatoide3, diabetes tipo2 4, doença inflamatória intestinal5 e lúpus eritematoso sistêmico (LES)6. No entanto, ainda não está claro se a microbiota intestinal é a principal causa ou um efeito secundário dessas doenças autoimunes7. Potencialmente, a microbiota intestinal poderia exacerbar a doença durante a fase efetora de doenças autoimunes ou desempenhar um papel na regulação da indução dessas doenças8.
Disbiose intestinal foi relatada em camundongos fêmeas com LMR/Mp-Faslpr (LMR/lpr) propensos a lúpus, e alterações na microbiota intestinal com uma depleção significativa de Lactobacilos foram observadas9. Quando uma mistura de cinco cepas de Lactobacillus foi administrada por via oral, sintomas semelhantes ao lúpus foram amplamente atenuados nesses camundongos, sugerindo um papel essencial da microbiota na regulação da patogênese do LES.
A seguinte técnica de extração de DNA permite acompanhar as flutuações da microbiota e analisá-las qualitativa e quantitativamente durante o curso da doença murina semelhante ao LES em camundongos propensos ao lúpus. Seja para examinar a microbiota intestinal saudável ou definir disbiose, é importante examinar criticamente como os dados são coletados e se são precisos e reprodutíveis10. Cada passo é fundamental nesse processo. Deve ser utilizada uma metodologia adequada para extrair ADN microbiano, uma vez que qualquer possível problema que introduza vieses durante o processo de extracção de ADN pode resultar numa representação microbiana imprecisa. Embora o método fenol-clorofórmio seja descrito aqui, existem kits comercialmente disponíveis para extrair DNA de bactérias que funcionam bem em casos particulares11. No entanto, sua usabilidade é limitada pelo custo e pela quantidade de amostra necessária.
O protocolo aqui apresentado é custo-efetivo e requer apenas uma pequena quantidade de amostra. Ele funciona bem com qualquer tipo de amostra de fezes e é útil no estudo da dinâmica da microbiota intestinal ao longo do tempo, bem como comparações entre grupos. O DNA é isolado com um método de purificação de álcool, que usa fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. A extração à base de álcool ajuda a limpar e remover a amostra de proteínas e lipídios, onde o DNA é precipitado na etapa final. O método proposto tem eficiência e qualidade significativamente altas e provou ser preciso na identificação de populações bacterianas. Uma observação crítica durante o procedimento é que a contaminação do DNA pode ocorrer e, portanto, o manuseio adequado da amostra é necessário12.
O DNA é então analisado pelas plataformas Next Generation Sequencing para o gene 16S rRNA, como o Illumina MiSeq. Em particular, a região hipervariável V4 é analisada para fornecer uma melhor quantificação para táxons de alto nível13. A análise bioinformática subsequente é terceirizada, seguida de análise interna usando métodos estatísticos padrão. Existem inúmeros softwares de bioinformática de código aberto disponíveis para sequenciamento a jusante, e o tipo de análise realizada depende fortemente da questão biológica específica de interesse14. Este protocolo se concentra especificamente nas etapas experimentais anteriores ao sequenciamento e fornece um método mais versátil, econômico, comparável e eficiente para obter DNA de amostras fecais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A microbiota intestinal equilibrada pode proteger o corpo humano de doenças. Uma vez que esse equilíbrio é interrompido por gatilhos externos ou internos, as consequências podem ser devastadoras. Este método apresenta uma forma de analisar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos murinos. O método é adequado não apenas para comparações entre grupos, mas também para rastrear a microbiota intestinal ao longo do tempo para identificar melhor os fatores dependentes do tempo que perturbam a microbiota intest…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a ajuda do Laboratório Nacional Argonne e de nossos bioinformáticos colaboradores. Este trabalho é apoiado por vários subsídios internos e do NIH.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
Referências
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