Her beskriver vi en protokol til opnåelse af rågiftekstrakt fra havanemonen og detekterer dens hæmolytiske og phospholipaseaktivitet.
Havanemongiftsammensætning indbefatter polypeptid- og ikke-proteinmolekyler. Cytolytiske komponenter har et højt bioteknologisk og biomedicinsk potentiale til at designe nye molekylære værktøjer. Havanemongift lokaliserer i kirtelceller fra ektoderm og subcellulære strukturer kaldet nematocysts, som begge er fordelt over hele havanemonens krop. Denne egenskab indebærer udfordringer, fordi cellerne og nematocystet skal lyseres for at frigive giftkomponenterne med andre ikke-toksiske molekyler. Derfor er giften for det første afledt af et råekstrakt (blanding af forskellige og forskellige molekyler og vævsaffald). Det næste skridt er at detektere polypeptider med specifikke bioaktiviteter. Her beskriver vi en effektiv strategi for at opnå havanemonens råekstrakt og bioassay for at identificere tilstedeværelsen af cytolysiner. Det første skridt involverer billige og ligetil teknikker (omrørt og fryse-optøningscyklus) til frigivelse af cytolysiner. Vi opnåede den højeste cytolytiske aktivitet og protein (~ 500 mg protein fra 20 g tørvægt). Dernæst blev ekstraktets polypeptidkompleksitet analyseret ved SDS-PAGE gel, der detekterede proteiner med molekylvægte mellem 10 kDa og 250 kDa. I det hæmolytiske assay brugte vi fårerøde blodlegemer og bestemte HU50 (11,1 ± 0,3 μg / ml). I modsætning hertil blev tilstedeværelsen af phospholipaser i råekstraktet bestemt under anvendelse af æggeblomme som substrat i et fast medium med agarose. Samlet set bruger denne undersøgelse en effektiv og billig protokol til at forberede råekstraktet og anvender replikerbare bioassays til at identificere cytolysiner, molekyler med bioteknologiske og biomedicinske interesser.
Havdyr er en rig kilde til biologisk aktive forbindelser. I de seneste årtier har sammensætningen af havanemongift tiltrukket sig videnskabelig opmærksomhed, da den omfatter en mangfoldighed af polypeptider med hæmolytisk, cytotoksisk, enzymatisk (phospholipase, protease, chitinase) og neurotoksisk aktivitet og hæmmende virkninger på proteolytisk aktivitet1. Derudover er disse polypeptider potentielle kilder til udvikling af molekylære værktøjer i bioteknologisk og terapeutisk anvendelse 2,3.
Der er få rapporter om havanemonegift og dets molekylære komponenter på grund af kompleksiteten ved at opnå giften, endda isolering og karakterisering af toksiner. De ekstraktionsmetoder, der blev anvendt i rapporterne, involverede lysis og tømning af indholdet af celler, der er relateret til og ikke relateret til giftproduktionen1.
Et særligt kendetegn hos alle cnidarians er fraværet af et system til produktion og frigivelse af giften centraliseret i en enkelt anatomisk region. I stedet er nematocysterne strukturer, der holder giften 4,5. Andre typer celler, kaldet epidermale kirtelceller, udskiller også toksiner og fordeles også i hele kroppen af havanemoner6.
Den første og mest afgørende udfordring ved at opnå giften er dannelsen af et ekstrakt med tilstrækkelig manipulation i efterfølgende processer uden inaktivering eller nedbrydning af labile proteiner. Dernæst skal cellerne lyseres, og komponenterne – i dette tilfælde polypeptider skal ekstraheres effektivt og hurtigt, idet proteolyse og hydrolyse undgås, samtidig med at andre cellulære komponenter elimineres7.
Forskellige metoder anvendes til at opnå det rå ekstrakt af en søanemone; nogle involverer at ofre organismen, mens andre tillader den at blive holdt i live. Metoder, der indebærer anvendelse af organismens hele krop, giver mulighed for frigivelse af de fleste toksiner fra giften8 sammenlignet med metoder, der holder organismer i live, som kun ekstraherer nogle komponenter i giften9. Fremstillingen af et ekstrakt kræver evaluering af tilstedeværelsen og styrken af et stof af interesse gennem et specifikt bioassay, som omfatter strategier til at observere de farmakologiske virkninger ved in vivo- eller in vitro-metoder 10.
Havanemongift indeholder cytolytiske polypeptider, poredannende toksiner (PFT’er)11 og phospholipaser12; disse molekyler er modeller i studiet af protein-lipidinteraktion, molekylære værktøjer i kræftterapi og biosensorer baseret på nanopore3. Klassificeringen af havanemon pft’er udføres i henhold til deres størrelse eller molekylvægt, fra 5 kDa til 80 kDa. 20 kDa PFT, den mest undersøgte og kendt som actinoporiner11, er af særlig interesse for sit biomedicinske potentiale i udviklingen af molekylære værktøjer til mulige anvendelser som anticancer-, antimikrobielle og nanoporebaserede biosensorer. Et andet cytolysin, herunder phospholipaser, specifikt phospholipase A2 (PLA2)13, frigiver en fedtsyre på grund af og hydrolyserer phospholipider, destabiliserer cellemembranen. På grund af denne virkningsmekanisme lover PLA2 at være en væsentlig model for undersøgelse og anvendelser i inflammatoriske sygdomme. Det kunne tjene som en model for undersøgelser af lipidadfærd i cellemembranen14.
Her beskriver vi en effektiv protokol til opnåelse af råekstraktet fra havanemonen Anthopleura dowii Verrill, 1869, og påvisning af hæmolysiner og phospholipaser. Begge er relevante toksiner, der kan bruges som skabelon til at designe nye molekylære værktøjer.
Den store efterspørgsel efter nye forbindelser med anvendelser inden for forskellige områder af videnskab og industri har ført til undersøgelsen af gift. Gift repræsenterer en rig kilde til molekyler, der tjener som en skabelon til generering af nye molekylære værktøjer. Kompleksiteten af disse gifte kræver imidlertid implementering og kombination af forskellige metoder til at opnå og studere dem.
Her viser vi en metode til at opnå og analysere giften fra havanemonen Anthopleura…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) med et tilskudsnummer IT200819. Forfatterne anerkender Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, for at kontrollere den engelske grammatik i dette manuskript; og teknisk bistand fra Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) og Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Vi takker også Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) for at have fået fåreblod. Vi takker især Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, for faciliteterne i hans laboratorium til videooptagelsen.
15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
Acrylamide | Promega | V3115 | |
Agarose | Promega | V3125 | |
Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
Petridish | Falcon | 351007 | |
Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |