التصوير الجزيئي الحيوي للامتصاص الخلوي للجسيمات النانوية باستخدام المجهر البصري غير الخطي متعدد الوسائط
Summary
تقدم هذه المقالة تكامل وحدة التركيز الطيفي وليزر النبض ثنائي الإخراج ، مما يتيح التصوير الطيفي السريع لجسيمات الذهب النانوية والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل التقنيات البصرية غير الخطية متعددة الوسائط على مجهر المسح الضوئي بالليزر القياسي.
Abstract
يعد فحص جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) في الأنظمة الحية أمرا ضروريا للكشف عن التفاعل بين AuNPs والأنسجة البيولوجية. علاوة على ذلك ، من خلال دمج الإشارات الضوئية غير الخطية مثل تشتت رامان المحفز (SRS) ، والتألق المثار ثنائي الفوتون (TPEF) ، والامتصاص العابر (TA) في منصة التصوير ، يمكن استخدامه للكشف عن التباين الجزيئي الحيوي للهياكل الخلوية و AuNPs بطريقة متعددة الوسائط. تقدم هذه المقالة مجهرا ضوئيا غير خطي متعدد الوسائط وتطبقه لإجراء تصوير كيميائي محدد ل AuNPs في الخلايا السرطانية. توفر منصة التصوير هذه نهجا جديدا لتطوير AuNPs وظيفية أكثر كفاءة وتحديد ما إذا كانت داخل الأوعية الدموية المحيطة بالورم أو المساحات المحيطة بالخلية أو الخلوية.
Introduction
أظهرت جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) إمكانات كبيرة كمجسات تصوير متوافقة حيويا ، على سبيل المثال ، كركائز فعالة لمطيافية رامان (SERS) المحسنة سطحيا في مختلف التطبيقات الطبية الحيوية. تشمل التطبيقات الرئيسية مجالات مثل الاستشعار الحيوي والتصوير الحيوي والتحليل الطيفي المعزز للسطح والعلاج الحراري الضوئي لعلاج السرطان1. علاوة على ذلك ، يعد فحص AuNPs في الأنظمة الحية أمرا بالغ الأهمية لتقييم وفهم التفاعل بين AuNPs والأنظمة البيولوجية. هناك العديد من التقنيات التحليلية ، بما في ذلك التحليل الطيفيللأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) 2 ، وقياس الطيف الكتلي المقترن بالحث بالاجتثاث بالليزر (LA-ICP-MS)3 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)4 التي تم استخدامها بنجاح للتحقيق في توزيع AuNPs في الأنسجة. ومع ذلك ، تعاني هذه الطرق من العديد من العيوب مثل كونها تستغرق وقتا طويلا وتتضمن تحضيرا معقداللعينة 3 ، أو تتطلب أوقات اكتساب طويلة ، أو عدم وجود دقة مكانية دون الميكرون 2,4.
بالمقارنة مع تقنيات التصوير التقليدية ، يوفر الفحص المجهري البصري غير الخطي العديد من المزايا لفحص الخلايا الحية و AuNPs: يحقق المجهر البصري غير الخطي عمق تصوير أعمق ويوفر قدرة التقسيم البصري 3D الجوهرية باستخدام الليزر فائق السرعة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. مع التحسن الكبير في سرعة التصوير وحساسية الكشف ، تم إثبات مضان متحمس ثنائي الفوتون (TPEF) 5،6،7 والجيل التوافقي الثاني (SHG) 8،9،10 المجهري لزيادة تحسين التصوير غير الجراحي للجزيئات الحيوية الداخلية في الخلايا والأنسجة الحية. علاوة على ذلك ، باستخدام تقنيات بصرية غير خطية جديدة لمسبار المضخة مثل الامتصاص العابر (TA) 11،12،13،14 وتشتت رامان المحفز (SRS) 15،16،17،18 ، من الممكن اشتقاق تباين كيميائي حيوي خال من الملصقات للهياكل الخلوية و AuNPs. يعد تصور AuNPs دون استخدام الملصقات الخارجية ذا أهمية كبيرة لأن الاضطرابات الكيميائية للجسيمات النانوية ستعدل خصائصها الفيزيائية وبالتالي امتصاصها في الخلايا.
يقدم هذا البروتوكول تنفيذ وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU) لليزر النبضي ثنائي الطول الموجي ، مما يتيح التصوير السريع متعدد الوسائط ل AuNPs والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل تقنيات TPEF و TA و SRS المتكاملة على مجهر المسح بالليزر.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدمت هذه الدراسة مزيجا من وحدة SF-TRU ونظام الليزر ثنائي الإخراج فائق السرعة الذي أظهر تطبيقاته في التحليل الطيفي متعدد الوسائط. بفضل قدرتها على التحقيق في امتصاص الخلايا السرطانية لجسيمات الذهب النانوية (AuNPs) ، يمكن لمنصة التصوير متعدد الوسائط تصور الاستجابات الخلوية لعلاجات السرطان شديدة…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل منح EPSRC: Raman Notheranostics (EP / R020965 / 1) ومرفق CONTRAST (EP / S009957 / 1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
Referências
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).
- Wang, C. -. C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -. C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -. C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -. C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
