Biomoleculaire beeldvorming van cellulaire opname van nanodeeltjes met behulp van multimodale niet-lineaire optische microscopie
Summary
Dit artikel presenteert de integratie van een spectrale focusmodule en een dual-output pulslaser, waardoor snelle hyperspectrale beeldvorming van gouden nanodeeltjes en kankercellen mogelijk wordt. Dit werk is bedoeld om de details van multimodale niet-lineaire optische technieken te demonstreren op een standaard laserscanmicroscoop.
Abstract
Het onderzoeken van gouden nanodeeltjes (AuNP’s) in levende systemen is essentieel om de interactie tussen AuNP’s en biologische weefsels te onthullen. Bovendien, door niet-lineaire optische signalen zoals gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS), twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) en transiënte absorptie (TA) in een beeldvormingsplatform te integreren, kan het worden gebruikt om biomoleculair contrast van cellulaire structuren en AuNP’s op een multimodale manier te onthullen. Dit artikel presenteert een multimodale niet-lineaire optische microscopie en past deze toe om chemisch specifieke beeldvorming van AuNP’s in kankercellen uit te voeren. Dit beeldvormingsplatform biedt een nieuwe benadering voor het ontwikkelen van efficiënter gefunctionaliseerde AuNP’s en het bepalen of ze zich in vasculatuur rond de tumor, pericellulaire of cellulaire ruimtes bevinden.
Introduction
Gouden nanodeeltjes (AuNP’s) hebben een groot potentieel getoond als biocompatibele beeldvormingsondes, bijvoorbeeld als effectieve oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie (SERS) substraten in verschillende biomedische toepassingen. Belangrijke toepassingen zijn gebieden zoals biosensing, bioimaging, oppervlakte-verbeterde spectroscopieën en fotothermische therapie voor kankerbehandeling1. Bovendien is het onderzoeken van AuNP’s in levende systemen cruciaal voor het beoordelen en begrijpen van de interactie tussen AuNP’s en biologische systemen. Er zijn verschillende analytische technieken, waaronder Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopie2, laserablatie inductief gekoppelde massaspectrometrie (LA-ICP-MS)3 en magnetische resonantie beeldvorming (MRI)4 die met succes zijn gebruikt om de verdeling van AuNP’s in weefsels te onderzoeken. Niettemin hebben deze methoden verschillende nadelen, zoals tijdrovend zijn en complexe monstervoorbereiding3 met zich meebrengen, die lange verwervingstijden vereisen, of het ontbreken van sub-micron ruimtelijke resolutie 2,4.
In vergelijking met conventionele beeldvormingstechnieken biedt niet-lineaire optische microscopie verschillende voordelen voor het onderzoeken van levende cellen en AuNP’s: de niet-lineaire optische microscopie bereikt een diepere beelddiepte en biedt intrinsieke 3D optische sectiemogelijkheden met behulp van bijna-IR ultrasnelle lasers. Met de significante verbetering van de beeldvormingssnelheid en detectiegevoeligheid is aangetoond dat twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF)5,6,7 en tweede harmonische generatie (SHG)8,9,10 microscopie niet-invasieve beeldvorming van endogene biomoleculen in levende cellen en weefsels verder verbeteren. Bovendien is het mogelijk om met behulp van nieuwe pomp-sonde niet-lineaire optische technieken zoals transiënte absorptie (TA)11,12,13,14 en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS)15,16,17,18, labelvrij biochemisch contrast van cellulaire structuren en AuNP’s af te leiden. Het visualiseren van AuNP’s zonder het gebruik van extrinsieke labels is van groot belang, omdat chemische verstoringen van de nanodeeltjes hun fysische eigenschappen en dus hun opname in cellen zullen wijzigen.
Dit protocol presenteert de implementatie van een Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) module voor een dual-golflengte pulslaser, waardoor snelle multimodale beeldvorming van AuNP’s en kankercellen mogelijk is. Dit werk is bedoeld om de details van geïntegreerde TPEF-, TA- en SRS-technieken op een laserscanmicroscoop te demonstreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie heeft de combinatie van SF-TRU-module en ultrasnel lasersysteem met dubbele uitgang gepresenteerd en zijn toepassingen voor multimodale microspectroscopie gedemonstreerd. Met zijn vermogen om de opname van gouden nanodeeltjes (AuNP’s) door kankercellen te onderzoeken, kan het multimodale beeldvormingsplatform de cellulaire reacties op hypertherme kankerbehandelingen visualiseren wanneer laserstralen worden geabsorbeerd door AuNP’s.
Bovendien worden snelle chemisch specifieke beeldv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) en CONTRAST facility (EP/S009957/1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
Referências
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).
- Wang, C. -. C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -. C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -. C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -. C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
