मल्टीमॉडल नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नैनोकणों के सेलुलर अपटेक की बायोमोलेक्यूलर इमेजिंग
Summary
यह लेख एक वर्णक्रमीय-फोकसिंग मॉड्यूल और एक दोहरे-आउटपुट पल्स लेजर के एकीकरण को प्रस्तुत करता है, जो सोने के नैनोकणों और कैंसर कोशिकाओं के तेजी से हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग को सक्षम करता है। इस काम का उद्देश्य एक मानक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर मल्टीमॉडल नॉनलाइनियर ऑप्टिकल तकनीकों के विवरण को प्रदर्शित करना है।
Abstract
जीवित प्रणालियों में सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) की जांच करना एयूएनपी और जैविक ऊतकों के बीच बातचीत को प्रकट करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, एक इमेजिंग प्लेटफॉर्म में उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस), दो-फोटॉन उत्तेजित फ्लोरेसेंस (टीपीईएफ), और क्षणिक अवशोषण (टीए) जैसे नॉनलाइनर ऑप्टिकल सिग्नल को एकीकृत करके, इसका उपयोग सेलुलर संरचनाओं और एयूएनपी के बायोमोलेक्यूलर कंट्रास्ट को मल्टीमॉडल तरीके से प्रकट करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख एक मल्टीमॉडल नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत करता है और इसे कैंसर कोशिकाओं में एयूएनपी की रासायनिक रूप से विशिष्ट इमेजिंग करने के लिए लागू करता है। यह इमेजिंग प्लेटफॉर्म अधिक कुशल कार्यात्मक एयूएनपी विकसित करने और यह निर्धारित करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है कि क्या वे ट्यूमर, पेरीसेलुलर या सेलुलर रिक्त स्थान के आसपास वास्कुलचर के भीतर हैं।
Introduction
सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) ने बायोकंपैटिबल इमेजिंग जांच के रूप में बड़ी क्षमता दिखाई है, उदाहरण के लिए, विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में प्रभावी सतह-संवर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसईआरएस) सब्सट्रेट के रूप में। प्रमुख अनुप्रयोगों मेंकैंसर उपचार के लिए बायोसेंसिंग, बायोइमेजिंग, सतह-संवर्धित स्पेक्ट्रोस्कोपी और फोटोथर्मल थेरेपी जैसे क्षेत्र शामिल हैं। इसके अलावा, जीवित प्रणालियों में एयूएनपी की जांच करना एयूएनपी और जैविक प्रणालियों के बीच बातचीत का आकलन और समझने के लिए महत्वपूर्ण है। फूरियर ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड (एफटीआईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी2, लेजर एब्लेशन अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलए-आईसीपी-एमएस)3, और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)4 सहित विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकें हैं जिनका उपयोग ऊतकों में एयूएनपी के वितरण की जांच के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। फिर भी, ये विधियां कई कमियों से ग्रस्त हैं जैसे कि समय लेने वाली और जटिल नमूना तैयारी3 को शामिल करना, लंबे अधिग्रहण समय की आवश्यकता होती है, या उप-माइक्रोन स्थानिक संकल्प 2,4 की कमी होती है।
पारंपरिक इमेजिंग तकनीकों की तुलना में, नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी लाइव कोशिकाओं और एयूएनपी की जांच के लिए कई फायदे प्रदान करती है: नॉनलाइनियर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी गहरी इमेजिंग गहराई प्राप्त करती है और निकट-आईआर अल्ट्राफास्ट लेजर के उपयोग के साथ आंतरिक 3 डी ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता प्रदान करती है। इमेजिंग गति और पहचान संवेदनशीलता के महत्वपूर्ण सुधार के साथ, दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति (टीपीईएफ) 5,6,7 और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) 8,9,10 माइक्रोस्कोपी को जीवित कोशिकाओं और ऊतकों में अंतर्जात बायोमोलेक्यूल्स के गैर-इनवेसिव इमेजिंग में और सुधार करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, क्षणिक अवशोषण (टीए) 11,12,13,14 और उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) 15,16,17,18 जैसे नए पंप-प्रोब नॉनलाइनियर ऑप्टिकल तकनीकों का उपयोग करके, सेलुलर संरचनाओं और एयूएनपी के लेबल-मुक्त जैव रासायनिक विपरीत प्राप्त करना संभव है। बाह्य लेबल के उपयोग के बिना एयूएनपी की कल्पना करना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि नैनोकणों के रासायनिक गड़बड़ी उनके भौतिक गुणों को संशोधित करेंगे और इसलिए कोशिकाओं में उनका उत्थान होगा।
यह प्रोटोकॉल दोहरी-तरंग दैर्ध्य पल्स लेजर के लिए स्पेक्ट्रल फोकसिंग टाइमिंग एंड रिकॉम्बिनेशन यूनिट (एसएफ-टीआरयू) मॉड्यूल के कार्यान्वयन को प्रस्तुत करता है, जो एयूएनपी और कैंसर कोशिकाओं की तेजी से मल्टीमॉडल इमेजिंग को सक्षम करता है। इस काम का उद्देश्य लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर एकीकृत टीपीईएफ, टीए और एसआरएस तकनीकों के विवरण को प्रदर्शित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन ने एसएफ-टीआरयू मॉड्यूल और अल्ट्राफास्ट डुअल-आउटपुट लेजर सिस्टम के संयोजन को प्रस्तुत किया है, जो मल्टीमॉडल माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए अपने अनुप्रयोगों का प्रदर्शन करता है। कैंसर कोशि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को ईपीएसआरसी अनुदान: रमन नैनोथेरेनोस्टिक्स (ईपी / आर 020965/1) और कंट्रास्ट सुविधा (ईपी / एस 009957/1) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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