マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング
Summary
本稿では、スペクトル集束モジュールとデュアル出力パルスレーザーを統合し、金ナノ粒子と癌細胞の高速ハイパースペクトルイメージングを可能にする方法について説明します。この研究は、標準的なレーザー走査型顕微鏡でマルチモーダル非線形光学技術の詳細を実証することを目的としています。
Abstract
生体系における金ナノ粒子(AuNP)の調査は、AuNPと生体組織との相互作用を明らかにするために不可欠です。さらに、誘導ラマン散乱(SRS)、2光子励起蛍光(TPEF)、過渡吸収(TA)などの非線形光信号をイメージングプラットフォームに統合することで、細胞構造とAuNPの生体分子コントラストをマルチモーダルに明らかにすることができます。本稿では、マルチモーダル非線形光学顕微鏡法を紹介し、それを応用して癌細胞におけるAuNPの化学的特異的イメージングを実行します。このイメージングプラットフォームは、より効率的に機能化されたAuNPを開発し、それらが腫瘍、細胞周囲、または細胞空間を取り巻く血管系内にあるかどうかを判断するための新しいアプローチを提供します。
Introduction
金ナノ粒子(AuNP)は、生体適合性イメージングプローブとして、例えば、さまざまな生物医学的用途における効果的な表面増強ラマン分光法(SERS)基板として大きな可能性を示しています。主な用途としては、バイオセンシング、バイオイメージング、表面増強分光、がん治療のための光熱療法などの分野が挙げられます1。さらに、生命系におけるAuNPの調査は、AuNPと生体系との相互作用を評価および理解するために重要です。フーリエ変換赤外(FTIR)分光法2、レーザーアブレーション誘導結合質量分析法(LA-ICP-MS)3、磁気共鳴画像法(MRI)4など、さまざまな分析技術を使用して組織内のAuNPの分布を調べることに成功しています。それにもかかわらず、これらの方法は、時間がかかり、複雑なサンプル調製を伴う3、長い取得時間を必要とする、またはサブミクロンの空間分解能の欠如2,4など、いくつかの欠点を抱いています。
従来のイメージング技術と比較して、非線形光学顕微鏡は生細胞とAuNPをプロービングするためのいくつかの利点を提供します:非線形光学顕微鏡は、より深いイメージング深度を達成し、近赤外超高速レーザーを使用して固有の3D光学セクショニング機能を提供します。イメージング速度と検出感度の大幅な向上により、2光子励起蛍光(TPEF)5,6,7および第2高調波発生(SHG)8,9,10顕微鏡法は、生細胞および組織における内因性生体分子の非侵襲的イメージングをさらに改善することが実証されています。さらに、過渡吸収(TA)11,12,13,14や誘導ラマン散乱(SRS)15,16,17,18などの新しいポンププローブ非線形光学技術を利用して、細胞構造とAuNPのラベルフリー生化学的コントラストを導き出すことができます。ナノ粒子の化学的摂動がそれらの物理的特性を変化させ、したがって細胞内での取り込みを変化させるため、外因性標識を使用せずにAuNPを視覚化することは非常に重要です。
このプロトコルは、AuNPと癌細胞の高速マルチモーダルイメージングを可能にする、2波長パルスレーザー用のスペクトル集束タイミングおよび再結合ユニット(SF-TRU)モジュールの実装を提示します。この研究は、レーザー走査型顕微鏡で統合されたTPEF、TA、およびSRS技術の詳細を実証することを目的としています。
Protocol
1.レーザーシステムのスイッチを入れる システムを起動する前に、インターロックシステムのスイッチを入れ、アームレーザーを選択してください。 ソフトウェアを使用してPCの電源を入れ、デュアル出力フェムト秒レーザーを制御します。 デュアル出力フェムト秒レーザーのソフトウェアをロードします。このソフトウェアにより、レーザーの電源のオ?…
Representative Results
スペクトル集束タイミングおよび再結合ユニット(SF-TRU)モジュールは、デュアル出力フェムト秒レーザーと修正レーザー走査型顕微鏡の間に導入されます。この研究で使用された調整可能な超高速レーザーシステムには、1つのビームを固定1,045 nmの波長で提供し、もう1つのビームを680〜1,300 nmの範囲で調整可能な2つの出力ポートを備えています。SF-TRUモジュールとマルチモーダルイメージン?…
Discussion
本研究では、SF-TRUモジュールと超高速デュアル出力レーザーシステムの組み合わせにより、マルチモーダル顕微分光法への応用を実証しました。マルチモーダルイメージングプラットフォームは、がん細胞による金ナノ粒子(AuNP)の取り込みを調査する機能により、レーザービームがAuNPに吸収された場合の温熱がん治療に対する細胞の応答を視覚化できます。
さらに、2組…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、EPSRC Grants: Raman Notheranostics (EP/R020965/1) および CONTRASTファシリティ (EP/S009957/1) の支援を受けた。
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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Citar este artigo
Wang, C., Mansfield, J. C., Stone, N., Moger, J. Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy. J. Vis. Exp. (183), e63637, doi:10.3791/63637 (2022).