Biomolekylær avbildning av cellulær opptak av nanopartikler ved bruk av multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi
Summary
Denne artikkelen presenterer integrasjonen av en spektralfokuseringsmodul og en dual-output pulslaser, som muliggjør rask hyperspektral avbildning av gull nanopartikler og kreftceller. Dette arbeidet tar sikte på å demonstrere detaljene i multimodale ikke-lineære optiske teknikker på et standard laserskanningsmikroskop.
Abstract
Sondering av gull nanopartikler (AuNPs) i levende systemer er viktig for å avsløre samspillet mellom AuNPs og biologiske vev. Videre, ved å integrere ikke-lineære optiske signaler som stimulert Raman-spredning (SRS), to-foton eksitert fluorescens (TPEF) og forbigående absorpsjon (TA) i en bildeplattform, kan den brukes til å avsløre biomolekylær kontrast av cellulære strukturer og AuNPs på en multimodal måte. Denne artikkelen presenterer en multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi og bruker den til å utføre kjemisk spesifikk avbildning av AuNPs i kreftceller. Denne bildebehandlingsplattformen gir en ny tilnærming for å utvikle mer effektive funksjonaliserte AuNPs og avgjøre om de er innenfor vaskulaturer som omgir svulsten, pericellulære eller cellulære rom.
Introduction
Gull nanopartikler (AuNPs) har vist stort potensial som biokompatible bildebehandlingsprober, for eksempel som effektive overflateforbedrede Raman-spektroskopi (SERS) substrater i ulike biomedisinske applikasjoner. Store applikasjoner inkluderer felt som biosensing, bioimaging, overflateforbedrede spektroskopier og fototermisk terapi for kreftbehandling1. Videre er sondering av AuNPs i levende systemer avgjørende for å vurdere og forstå samspillet mellom AuNPs og biologiske systemer. Det finnes ulike analytiske teknikker, inkludert Fourier transform infrared (FTIR) spektroskopi2, laserablasjon induktivt koblet massespektrometri (LA-ICP-MS) 3, og magnetisk resonansavbildning (MR) 4 som har blitt brukt til å undersøke fordelingen av AuNPs i vev. Likevel lider disse metodene av flere ulemper, for eksempel å være tidkrevende og involvere kompleks prøvepreparering3, som krever lange anskaffelsestider, eller mangelen på sub-mikron romlig oppløsning 2,4.
Sammenlignet med konvensjonelle bildebehandlingsteknikker, gir ikke-lineær optisk mikroskopi flere fordeler for sondering av levende celler og AuNPs: Den ikke-lineære optiske mikroskopien oppnår dypere bildedybde og gir egen 3D optisk seksjoneringskapasitet ved bruk av nær-IR ultrafaste lasere. Med den betydelige forbedringen av bildehastighet og deteksjonsfølsomhet har to-foton eksitert fluorescens (TPEF) 5,6,7 og andre harmoniske generasjon (SHG) 8,9,10 mikroskopi vist seg å ytterligere forbedre ikke-invasiv avbildning av endogene biomolekyler i levende celler og vev. Videre er det mulig å utlede etikettfri biokjemisk kontrast av cellulære strukturer og AuNP-er ved å bruke nye ikke-lineære optiske teknikker som forbigående absorpsjon (TA)11,12,13,14 og stimulert Raman-spredning (SRS)15,16,17,18. Visualisering av AuNPs uten bruk av ekstrinsiske etiketter er av stor betydning siden kjemiske forstyrrelser av nanopartiklene vil endre deres fysiske egenskaper og dermed deres opptak i celler.
Denne protokollen presenterer implementeringen av en Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) modul for en dual-bølgelengde pulslaser, noe som muliggjør rask multimodal avbildning av AuNPs og kreftceller. Dette arbeidet tar sikte på å demonstrere detaljene i integrerte TPEF-, TA- og SRS-teknikker på et laserskanningsmikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien har presentert kombinasjonen av SF-TRU-modul og ultrafast dual-output lasersystem demonstrerte sine applikasjoner for multimodal mikrospektroskopi. Med sin evne til å undersøke gull nanopartikler ‘(AuNPs) opptak av kreftceller, kan den multimodale bildebehandlingsplattformen visualisere cellulære responser på hypertermiske kreftbehandlinger når laserstråler absorberes av AuNPs.
Videre oppnås rask kjemisk spesifikk avbildning og høy spektral oppløsning ved å bruke spektr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP / R020965 / 1) og CONTRAST facility (EP / S009957 / 1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
Referências
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).
- Wang, C. -. C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -. C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -. C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -. C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
