Биомолекулярная визуализация клеточного поглощения наночастиц с использованием мультимодальной нелинейной оптической микроскопии
Summary
В этой статье представлена интеграция модуля спектральной фокусировки и импульсного лазера с двойным выходом, что позволяет быстро гиперспектральную визуализацию наночастиц золота и раковых клеток. Эта работа направлена на демонстрацию деталей мультимодальных нелинейных оптических методов на стандартном лазерном сканирующем микроскопе.
Abstract
Зондирование наночастиц золота (AuNPs) в живых системах имеет важное значение для выявления взаимодействия между AuNP и биологическими тканями. Кроме того, интегрируя нелинейные оптические сигналы, такие как стимулированное рамановское рассеяние (SRS), двухфотонная возбужденная флуоресценция (TPEF) и переходное поглощение (TA), в платформу визуализации, он может быть использован для выявления биомолекулярного контраста клеточных структур и AuNP мультимодальным способом. В этой статье представлена мультимодальная нелинейная оптическая микроскопия и она применяется для выполнения химически специфической визуализации AuNP в раковых клетках. Эта платформа визуализации обеспечивает новый подход к разработке более эффективных функционализированных AuNP и определению того, находятся ли они в сосудистом пространстве, окружающем опухоль, перицеллюлярном или клеточном пространстве.
Introduction
Наночастицы золота (AuNPs) показали большой потенциал в качестве биосовместимых зондов визуализации, например, в качестве эффективных поверхностных рамановских спектроскопических субстратов (SERS) в различных биомедицинских приложениях. Основные области применения включают такие области, как биозондирование, биовизуализация, поверхностно-усиленные спектроскопии и фототермическая терапия для лечения рака1. Кроме того, зондирование AuNP в живых системах имеет решающее значение для оценки и понимания взаимодействия между AuNP и биологическими системами. Существуют различные аналитические методы, в том числе инфракрасная спектроскопияс преобразованием Фурье (FTIR) 2, масс-спектрометрия с лазерной абляцией с индуктивной связью (LA-ICP-MS)3 и магнитно-резонансная томография (МРТ)4, которые успешно используются для исследования распределения AuNP в тканях. Тем не менее, эти методы страдают от ряда недостатков, таких как трудоемкость и сложная пробоподготовка3, требующая длительного времени сбора или отсутствие субмикронного пространственного разрешения 2,4.
По сравнению с обычными методами визуализации, нелинейная оптическая микроскопия предлагает несколько преимуществ для зондирования живых клеток и AuNP: нелинейная оптическая микроскопия достигает большей глубины изображения и обеспечивает внутреннюю возможность 3D-оптического сечения с использованием ближне-ИК-сверхбыстрых лазеров. Со значительным улучшением скорости визуализации и чувствительности обнаружения, двухфотонная возбужденная флуоресценция (TPEF)5,6,7 и вторая гармоническая генерация (SHG)8,9,10 микроскопия были продемонстрированы для дальнейшего улучшения неинвазивной визуализации эндогенных биомолекул в живых клетках и тканях. Кроме того, используя новые нелинейные оптические методы насоса-зонда, такие как переходное поглощение (TA)11,12,13,14 и стимулированное комбинационное рассеяние (SRS)15,16,17,18, можно получить безметочный биохимический контраст клеточных структур и AuNP. Визуализация AuNP без использования внешних меток имеет большое значение, поскольку химические возмущения наночастиц будут изменять их физические свойства и, следовательно, их поглощение в клетках.
Этот протокол представляет собой реализацию модуля Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) для двухволнового импульсного лазера, что позволяет быстро получать мультимодальную визуализацию AuNP и раковых клеток. Эта работа направлена на демонстрацию деталей интегрированных методов TPEF, TA и SRS на лазерном сканирующем микроскопе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование представило комбинацию модуля SF-TRU и сверхбыстрой лазерной системы с двойным выходом, продемонстрировав ее применение для мультимодальной микроспектроскопии. Благодаря своей способности исследовать поглощение наночастицами золота (AuNPs) раковыми клетками, мультимод?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами EPSRC: рамановская нанотеранотика (EP/R020965/1) и установка CONTRAST (EP/S009957/1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
Referências
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).
- Wang, C. -. C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -. C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -. C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -. C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
