Bu makalede, altın nanopartiküllerin ve kanser hücrelerinin hızlı hiperspektral görüntülenmesini sağlayan spektral odaklama modülü ve çift çıkışlı darbe lazerinin entegrasyonu sunulmaktadır. Bu çalışma, multimodal doğrusal olmayan optik tekniklerin ayrıntılarını standart bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.
Canlı sistemlerde altın nanopartiküllerin (AuNP’ler) araştırılması, AuNP’ler ve biyolojik dokular arasındaki etkileşimi ortaya çıkarmak için gereklidir. Ayrıca, uyarılmış Raman saçılması (SRS), iki foton uyarılmış floresan (TPEF) ve geçici absorpsiyon (TA) gibi doğrusal olmayan optik sinyalleri bir görüntüleme platformuna entegre ederek, hücresel yapıların ve AuNP’lerin biyomoleküler kontrastını multimodal bir şekilde ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu makalede multimodal doğrusal olmayan optik mikroskopi sunulmakta ve kanser hücrelerinde AuNP’lerin kimyasal olarak spesifik görüntülenmesini gerçekleştirmek için uygulanmaktadır. Bu görüntüleme platformu, daha verimli işlevselleştirilmiş AuNP’ler geliştirmek ve tümörü, perisellüler veya hücresel alanları çevreleyen vaskülatürler içinde olup olmadıklarını belirlemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
Altın nanopartiküller (AuNP’ler), biyouyumlu görüntüleme probları olarak, örneğin çeşitli biyomedikal uygulamalarda etkili yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) substratları olarak büyük potansiyel göstermiştir. Başlıca uygulamalar arasında biyoalgılama, biyogörüntüleme, yüzey geliştirilmiş spektroskopiler ve kanser tedavisi için fototermal tedavi gibi alanlarbulunmaktadır 1. Ayrıca, canlı sistemlerdeki AuNP’lerin araştırılması, AuNP’ler ve biyolojik sistemler arasındaki etkileşimi değerlendirmek ve anlamak için çok önemlidir. AuNP’lerin dokulardaki dağılımını araştırmak için başarıyla kullanılan Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi2, lazer ablasyon endüktif olarak eşleşmiş kütle spektrometresi (LA-ICP-MS)3 ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI)4 dahil olmak üzere çeşitli analitik teknikler vardır. Bununla birlikte, bu yöntemler zaman alıcı olmak ve karmaşık numune hazırlama3’ü içeren, uzun edinme süreleri gerektiren veya mikronun altındaki uzamsal çözünürlük 2,4’ün eksikliği gibi çeşitli dezavantajlardan muzdariptir.
Geleneksel görüntüleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, doğrusal olmayan optik mikroskopi, canlı hücrelerin ve AuNP’lerin araştırılması için çeşitli avantajlar sunar: Doğrusal olmayan optik mikroskopi, daha derin görüntüleme derinliği elde eder ve IR’ye yakın ultra hızlı lazerlerin kullanımıyla içsel 3D optik kesitleme yeteneği sağlar. Görüntüleme hızının ve algılama duyarlılığının önemli ölçüde artmasıyla, iki foton uyarılmış floresan (TPEF) 5,6,7 ve ikinci harmonik jenerasyon (SHG) 8,9,10 mikroskopisinin canlı hücrelerde ve dokularda endojen biyomoleküllerin non-invaziv görüntülemesini daha da geliştirdiği gösterilmiştir. Ayrıca, geçici absorpsiyon (TA)11,12,13,14 ve uyarılmış Raman saçılması (SRS)15,16,17,18 gibi yeni pompa-prob doğrusal olmayan optik teknikleri kullanarak, hücresel yapıların ve AuNP’lerin etiketsiz biyokimyasal kontrastını elde etmek mümkündür. AuNP’leri dışsal etiketler kullanmadan görselleştirmek büyük önem taşımaktadır, çünkü nanopartiküllerin kimyasal pertürbasyonları fiziksel özelliklerini ve dolayısıyla hücrelerdeki alımlarını değiştirecektir.
Bu protokol, çift dalga boylu darbeli bir lazer için bir Spektral Odaklama Zamanlama ve Rekombinasyon Birimi (SF-TRU) modülünün uygulanmasını sunarak, AuNP’lerin ve kanser hücrelerinin hızlı multimodal görüntülemesini sağlar. Bu çalışma, entegre TPEF, TA ve SRS tekniklerinin ayrıntılarını bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.
Bu çalışmada SF-TRU modülü ve ultra hızlı çift çıkışlı lazer sisteminin kombinasyonu sunulmuş ve multimodal mikrospektroskopi için uygulamaları gösterilmiştir. Altın nanopartiküllerin (AuNP’ler) kanser hücreleri tarafından alımını araştırma yeteneği ile multimodal görüntüleme platformu, lazer ışınları AuNP’ler tarafından emildiğinde hipertermik kanser tedavilerine hücresel yanıtları görselleştirebilir.
Ayrıca, hızlı kimyasal olarak spesifik görünt…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP / R020965 / 1) ve CONTRAST tesisi (EP / S009957 / 1) tarafından desteklenmiştir.
APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |