RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus
Summary
Burada, gen fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Bursaphelenchus xylophilus’ta RNA girişiminin ayrıntılı bir ıslatma yöntemini tanıtıyoruz.
Abstract
Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, dünya çapında en yıkıcı istilacı türlerden biridir ve çam ağaçlarının solmasına ve nihayetinde ölümüne neden olur. Ekonomik ve çevresel önemlerinin tanınmasına rağmen, geleneksel ileri genetik ve transgenik yöntemler kullanarak bitki-parazitik nematodların (PPN’ler) ayrıntılı gen fonksiyonlarını incelemek şimdiye kadar imkansız olmuştur. Bununla birlikte, ters genetik bir teknoloji olarak, RNA girişimi (RNAi), B. xylophilus da dahil olmak üzere nematodların fonksiyonel genlerinin incelenmesini kolaylaştırır.
Bu makalede, diğer patojenik nematodların gelişiminde ve çoğaltılmasında önemli rol oynadığı bildirilen B. xylophilus’taki ppm-1 geninin RNAi için yeni bir protokol özetlenmektedir. RNAi için, T7 promotörü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile hedef fragmanın 5′-terminaline bağlandı ve çift sarmallı RNA (dsRNA) in vitro transkripsiyon ile sentezlendi. Daha sonra, dsRNA dağıtımı, nematodların sentetik nörostimülanlarla karıştırılmış bir dsRNA çözeltisine batırılmasıyla gerçekleştirildi. B. xylophilus’un senkronize yavruları (yaklaşık 20.000 kişi) yıkandı ve 25 ° C’de karanlıkta 24 saat boyunca ıslatma tamponunda dsRNA’ya (0.8 μg / mL) batırıldı.
Aynı miktarda nematod, kontrol olarak dsRNA olmadan ıslatıcı bir tampona yerleştirildi. Bu arada, aynı miktarda nematod, kontrol olarak yeşil floresan protein (gfp) geni dsRNA ile ıslatma tamponuna yerleştirildi. Islattıktan sonra, hedef transkriptlerin ekspresyon seviyesi gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanılarak belirlendi. RNAi’nin etkileri daha sonra fenotiplerin mikroskobik gözlemi ve yetişkinler arasındaki vücut büyüklüğünün karşılaştırılması kullanılarak doğrulandı. Mevcut protokol, genetik mühendisliği yoluyla kontrol stratejileri geliştirmeye yönelik B. xylophilus ve diğer parazitik nematodların genlerinin işlevlerini daha iyi anlamak için araştırmaların ilerlemesine yardımcı olabilir.
Introduction
Bitki-paraziter nematodlar (PPN’ler) gıda güvenliği ve orman ekosistemleri için devam eden bir tehdittir. Her yıl tahmini 100 milyar ABD doları ekonomik kayba neden olurlar1, bunların en sorunlu olanları öncelikle kök-düğüm nematodları, kist nematodları ve çam ağacı nematodlarıdır. Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, çam solgunluğu hastalığının nedensel patojeni olan göçmen, endoparaziter bir nematoddur2. Dünya çapında çam ormanlarına büyük zarar vermiştir3. Van Megen ve ark.4’ün terminolojisini kullanarak, B. xylophilus Parasitaphelenchidae’nin bir üyesidir ve klad 10’a aittir, oysa diğer büyük bitki parazitlerinin çoğu klad 12’ye aittir.
Bağımsız ve yakın zamanda evrimleşmiş bir bitki paraziti olan B. xylophilus , karşılaştırmalı çalışmalar için çekici bir modeldir. Bugüne kadar, zorunlu, sedanter endoparazitler olan ve en yoğun çalışılan nematodlardan bazıları olan klad 12’ye ait kök-düğüm nematodları ve kist nematodları hakkında önemli araştırmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, bu önemli alanda daha fazla araştırma yapmak büyük bir zorlukla birlikte gelir: parazitizm genlerinin işlevi bir araştırma darboğazıdır. Fonksiyonel çalışmalar genellikle ektopik ekspresyon ve nakavt / çıkış deneylerini içerir, ancak nematod için etkili genetik dönüşüm protokollerine dayanır. Sonuç olarak, PPN’lerdeki ters genetik neredeyse sadece RNAi tarafından gen susturulmasına dayanır.
Ökaryotik hücrelerde yaygın olarak bulunan bir mekanizma olan RNAi, çift sarmallı RNA (dsRNA)5 ekleyerek gen ekspresyonunu susturur. Bugüne kadar, dsRNA tarafından indüklenen posttranskripsiyonel gen susturma mekanizması, çalışılan tüm ökaryotlarda bulunmuştur ve fonksiyonel genomik araştırmaların ve diğer uygulamaların bir aracı olarak RNAi teknolojisi, birçok organizmada hızla gelişmiştir. 1998 yılında Caenorhabditis elegans’ta RNAi makinesinin keşfinden bu yana6, RNAi teknikleri nematodların gen fonksiyonunu tanımlamak için etkili yöntemler haline gelmiştir ve patojenik nematodları etkili bir şekilde kontrol etmenin yeni bir yolu olarak önerilmiştir7.
RNAi teknik olarak gençleri dsRNA’ya batırmak yeterli olabilir; Bununla birlikte, bu yaklaşımın etkinliği ve tekrarlanabilirliği, nematod türleri ve hedef gen8 ile büyük ölçüde değişmektedir. Kök-düğüm nematodunun RNAi yollarında yer alan 20 genin susturulması, Meloidogyne incognita, tetikleyici olarak uzun dsRNA’lar kullanılarak araştırıldı ve bazı genlerin ekspresyonunda bir artış ve hiçbir değişiklik olmaması da dahil olmak üzere çeşitli tepkilerle sonuçlandı9. Bu sonuçlar, hedef genlerin RNAi nakavtına farklı tepki verebileceğini ve RNAi yoluyla nematod kontrolü için hedef olarak uygunluklarının kapsamlı bir değerlendirmesini gerektirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, şu anda B. xylophilus’un gelişim ve üreme biyolojisi üzerine araştırma yetersizliği vardır.
Önceki çalışmanın devamı olarak10,11,12,13, burada dsRNA sentezi, sentetik nörostimülan ıslatma ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tespiti dahil olmak üzere B. xylophilus’un ppm-1 geninin işlevini incelemek için RNAi’nin uygulanması için bir protokol açıklıyoruz. Bu deneysel yaklaşımdan elde edilen bilgiler muhtemelen temel biyolojik sistemlerin anlaşılmasına ve çam solgunluğu hastalığının önlenmesine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
B. xylophilus’un yaşam öyküsü ve paraziter ortamı diğer nematodlarınkinden farklı olmasına rağmen, bu bitki patojeninin moleküler patogenezi hakkında sınırlı araştırma yapılmıştır. C. elegans ve diğer nematodlarda CRISPR / Cas9 genom düzenleme teknolojisinin uygulanmasında büyük ilerleme kaydedilmesine rağmen, bugüne kadar sadece B. xylophilus’a uygulanan RNAi teknolojisiyayınlanmıştır 17. RNAi, nematodların gen fonksiyonunu incelemek i?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31870637, 31200487) tarafından finanse edildi ve Zhejiang Anahtar Araştırma Planı (2019C02024, LGN22C160004) tarafından ortaklaşa finanse edildi.
Materials
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
Referências
- Nicol, J. M., Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. , 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
