تقييم الاحتمال المفتوح لمسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا في إعداد فائض الإنزيم المساعد Q
Summary
تستغل هذه الطريقة مساهمة مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا في تسرب البروتون منخفض التوصيل لتحديد عتبة الجهد لفتح المسام في فئران متلازمة X الهشة لحديثي الولادة مع زيادة محتوى الإنزيم المساعد للميتوكوندريا في الخلايا العضلية القلبية Q مقارنة بالتحكم في النمط البري.
Abstract
مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا (mPTP) هي قناة ضخمة ذات بوابات جهد كهربائي وغير انتقائية وغشاء ميتوكوندريا داخلي (IMM) مهم في الصحة والمرض. يتوسط mPTP تسرب البروتونات عبر IMM أثناء الفتح منخفض التوصيل ويتم تثبيطه على وجه التحديد بواسطة السيكلوسبورين A (CsA). الإنزيم المساعد Q (CoQ) هو منظم ل mPTP ، وقد تم العثور على اختلافات خاصة بالأنسجة في محتوى CoQ والاحتمال المفتوح ل mPTP في الميتوكوندريا الأمامية والقلب في نموذج فأر حديث الولادة من متلازمة X الهشة (FXS ، Fmr1 بالضربة القاضية). قمنا بتطوير تقنية لتحديد عتبة الجهد لفتح mPTP في هذه السلالة المتحولة ، مستغلين دور mPTP كقناة تسرب بروتون.
للقيام بذلك ، تم قياس استهلاك الأكسجين وجهد الغشاء (ΔΨ) في وقت واحد في الميتوكوندريا المعزولة باستخدام الاستقطاب والقطب الكهربائي الانتقائي الأيوني رباعي الفينيل فوسفونيوم (TPP+) أثناء التنفس التسرب. تم تحديد عتبة فتح mPTP من خلال بداية تثبيط تسرب البروتون بوساطة CsA عند إمكانات غشاء محددة. باستخدام هذا النهج ، تم تحديد الاختلافات في بوابات الجهد ل mPTP بدقة في سياق فائض CoQ. ستسمح هذه التقنية الجديدة بإجراء تحقيق مستقبلي لتعزيز فهم التنظيم الفسيولوجي والمرضي لفتح mPTP منخفض التوصيل.
Introduction
يتوسط mPTP انتقال النفاذية (PT) ، حيث يصبح IMM قابلا للنفاذ فجأة للجزيئات الصغيرة ويذيب 1,2. هذه الظاهرة المذهلة هي خروج واضح عن النفاذية المميزة ل IMM ، وهو أمر أساسي لإنشاء التدرج الكهروكيميائي الضروري للفسفرة التأكسدية3. PT ، على عكس آليات نقل الميتوكوندريا الأخرى ، هي عملية عالية التوصيل وغير محددة وغير انتقائية ، مما يسمح بمرور مجموعة من الجزيئات حتى 1.5 kDa 4,5. mPTP هي قناة ذات بوابات جهد داخل IMM يغير فتحها ΔΨ ، وإنتاج ATP ، وتوازن الكالسيوم ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وجدوى الخلية4.
في أقصى الحدود المرضية ، يؤدي الفتح عالي التوصيل غير المنضبط والمطول ل mPTP إلى انهيار التدرج الكهروكيميائي ، وتورم المصفوفة ، واستنفاد نيوكليوتيدات البيريدين المصفوفة ، وتمزق الغشاء الخارجي ، وإطلاق البروتينات بين الأغشية (بما في ذلك السيتوكروم c) ، وفي النهاية ، موت الخلايا 4,6. وقد تورط هذا الفتح المرضي mPTP في إصابة نقص تروية القلب ، وفشل القلب ، وإصابات الدماغ الرضحية ، والأمراض العصبية التنكسية المختلفة ، والسكري1،7. ومع ذلك ، فإن فتح mPTP منخفض التوصيل هو فسيولوجي بطبيعته ، وعلى عكس الفتحة عالية التوصيل ، لا يؤدي إلى إزالة الاستقطاب العميق أو تورم الميتوكوندريا4.
يفتح التوصيل المنخفض للمسام النفاذية إلى ~ 300 Da ، ويسمح بمرور البروتونات بشكل مستقل عن تخليق ATP ، وهو مصدر محتمل لتسرب البروتون الفسيولوجي5. يؤدي فتح mPTP الفسيولوجي إلى انخفاض متحكم فيه في ΔΨ ، ويزيد من تدفق الإلكترون عبر سلسلة النقل التنفسية ، ويؤدي إلى انفجار قصير أو وميض من الأكسيد الفائق ، مما يساهم في إشارات ROS8. يعد تنظيم فتحة mPTP العابرة مهمة لتوازن الكالسيوم والتطور الخلوي الطبيعي والنضج4،9،10،11. على سبيل المثال ، يؤدي فتح المسام العابر في الخلايا العصبية النامية إلى التمايز ، في حين أن إغلاق mPTP يحفز النضج في الخلايا العضلية القلبية غير الناضجة 4,5.
على الرغم من أن الأهمية الوظيفية ل mPTP في الصحة والمرض راسخة ، إلا أن هويتها الجزيئية الدقيقة لا تزال موضع نقاش. وقد تم استعراض التقدم المحرز في البنية الجزيئية ووظيفة mPTP بشكل شامل في مكان آخر12. باختصار ، في الوقت الحالي ، تم افتراض حالات التوصيل العالية والمنخفضة ل mPTP على أنها تتوسط فيها كيانات متميزة12. المرشحون الرئيسيون هم F1 / F0 ATP synthase (ATP synthase) وناقل نيوكليوتيدات الأدينين (ANT) لأوضاع التوصيل العالي والمنخفض ، على التوالي12.
على الرغم من عدم وجود توافق في الآراء بشأن الهوية الدقيقة لمكون تشكيل المسام في mPTP ، فقد تم تفصيل بعض الخصائص الرئيسية. ميزة راسخة من mPTP هو أنه يتم تنظيمه بواسطة التدرج الكهروكيميائي بحيث يؤدي إزالة الاستقطاب من IMM إلى فتح المسام13. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن حالة الأكسدة والاختزال لمجموعات الثيول الفيكينال تغير بوابة الجهد ل mPTP ، بحيث تفتح الأكسدة المسام عند ΔΨs أعلى نسبيا ، ويؤدي تقليل مجموعة الثيول إلى احتمال mPTP مغلق14. ومع ذلك ، فإن هوية مستشعر الجهد البروتيني غير معروفة.
تم تحديد جزيئات صغيرة مختلفة تعدل الاحتمال المفتوح للمسام. على سبيل المثال ، يمكن تحفيز mPTP لفتحه باستخدام الكالسيوم والفوسفات غير العضوي والأحماض الدهنية و ROS ويمكن تثبيطه بواسطة نيوكليوتيدات الأدينين (خاصة ADP) والمغنيسيوم والبروتونات و CsA 5,12. وقد تم توضيح آليات عمل بعض هذه الهيئات التنظيمية. يحفز الكالسيوم الميتوكوندريا فتح mPTP جزئيا على الأقل عن طريق الارتباط بالوحدة الفرعية β من ATP synthase15. يمكن ل ROS تنشيط mPTP عن طريق تقليل تقاربه مع ADP وتعزيز تقاربه مع cyclophilin D (CypD) ، وهو أفضل منشط mPTP بروتيني تمت دراسته16. آلية تنشيط mPTP بواسطة الفوسفات غير العضوي والأحماض الدهنية أقل وضوحا. أما بالنسبة للمثبطات الداخلية المنشأ ، يعتقد أن ADP يثبط mPTP عن طريق الارتباط في سينثاز ANT أو ATP ، بينما يمارس المغنيسيوم تأثيره المثبط عن طريق إزاحة الكالسيوم من موقع الارتباط15،17،18،19.
يمنع انخفاض الأس الهيدروجيني فتح mPTP عن طريق بروتونات الهيستيدين 112 من الوحدة الفرعية التنظيمية للبروتين الذي يمنح حساسية الأوليغوميسين (OSCP) من سينثاز ATP12,20,21. يعمل المثبط الدوائي النموذجي ل mPTP ، CsA ، عن طريق ربط CypD ومنع ارتباطه ب OSCP22,23. وقد أظهرت الأعمال السابقة أيضا أن مجموعة متنوعة من نظائر CoQ تتفاعل مع mPTP ، مما يثبطها أو ينشطها24. في العمل الأخير ، وجدنا أدلة على وجود mPTP مفتوح مرضيا ، وتسرب مفرط للبروتون ، وفسفرة تأكسدية غير فعالة بسبب نقص CoQ في الميتوكوندريا الأمامية للدماغ من الجراء الفأر FXS حديثي الولادة25.
أدى إغلاق المسام باستخدام CoQ الخارجي إلى منع تسرب البروتون المرضي وأدى إلى النضج المورفولوجي للأشواك المتغصنة25. ومن المثير للاهتمام ، في نفس الحيوانات ، كان لدى الخلايا العضلية القلبية FXS مستويات CoQ مفرطة واحتمال mPTP مغلق مقارنة بعناصر التحكم في النوع البري26. على الرغم من أن سبب هذه الاختلافات الخاصة بالأنسجة في مستويات CoQ غير معروف ، إلا أن النتائج تؤكد على مفهوم أن CoQ الداخلي المنشأ من المحتمل أن يكون منظما رئيسيا ل mPTP. ومع ذلك ، هناك فجوة كبيرة في معرفتنا لأن آلية تثبيط mPTP بوساطة CoQ لا تزال غير معروفة.
تنظيم mPTP هو محدد حاسم لإشارات الخلية والبقاء على قيد الحياة4. وبالتالي ، فإن اكتشاف فتحة mPTP داخل الميتوكوندريا أمر أساسي عند النظر في آليات فسيولوجية مرضية محددة. عادة ، يتم تحديد عتبة فتح المسام عالية التوصيل باستخدام الكالسيوم لتحفيز انتقال النفاذية. يؤدي تحميل الكالسيوم هذا إلى انهيار إمكانات الغشاء ، والفصل السريع للفسفرة التأكسدية ، وتورم الميتوكوندريا27,28. لقد سعينا إلى تطوير طريقة للكشف عن فتحة mPTP منخفضة التوصيل في الموقع ، دون تحفيزها في حد ذاتها.
يستغل النهج دور mPTP كقناة تسرب بروتون. للقيام بذلك ، تم استخدام أقطاب كلارك تايب و TPP + الانتقائية للأيونات لقياس استهلاك الأكسجين وإمكانات الغشاء في وقت واحد ، على التوالي ، في الميتوكوندريا المعزولة أثناء التنفس المتسرب29. تم تحديد عتبة فتح mPTP من خلال بداية تثبيط تسرب البروتون بوساطة CsA عند إمكانات غشاء محددة. باستخدام هذا النهج ، تم تحديد الاختلافات في بوابة الجهد ل mPTP في سياق فائض CoQ بدقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة طريقة لتقييم الاحتمال المفتوح ل mPTP. على وجه التحديد ، تم تحديد عتبة الجهد لفتح mPTP منخفض التوصيل من خلال تقييم تأثير تثبيط CsA على تسرب البروتون عبر مجموعة من ΔΨs. باستخدام هذه التقنية، يمكننا تحديد الاختلافات في بوابات الجهد ل mPTP بين فئران FXS وعناصر تحكم FVB بما يتفق مع اختلافاته…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.) ، وجائزة مركز إيرفينغ الطبي المستهدف من جامعة كولومبيا لعميد الفرص لقسم التخدير (K.K.G.) ، وجائزة جمعية أبحاث الباحث الشاب في تخدير الأطفال (K.K.G.) ، و NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
Referências
- Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
- Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
- Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W., Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).
- Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Biologia do Desenvolvimento. 426 (1), 1-7 (2017).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
- Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
- Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
- Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
- Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
- Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
- Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
- Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
- Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
- Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
- Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
- Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
- Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
- Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
- Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
- Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
- Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
- Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
- Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
- Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).
- Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
- Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).
- Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).
- Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
- Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
- Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).
