Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie in de setting van co-enzym Q-overmaat
Summary
Deze methode maakt gebruik van de bijdrage van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie aan protonlek met lage geleiding om de spanningsdrempel voor porieopening te bepalen bij neonatale fragiele X-syndroommuizen met een verhoogd cardiomyocyt mitochondriaal co-enzym Q-gehalte in vergelijking met wildtypecontrole.
Abstract
De mitochondriale permeabiliteitstransitieporie (mPTP) is een voltage-gated, niet-selectief, inner mitochondriaal membraan (IMM) megakanaal dat belangrijk is in gezondheid en ziekte. De mPTP bemiddelt lekkage van protonen over de IMM tijdens opening met lage geleiding en wordt specifiek geremd door ciclosporine A (CsA). Co-enzym Q (CoQ) is een regulator van de mPTP en weefselspecifieke verschillen zijn gevonden in CoQ-gehalte en open waarschijnlijkheid van de mPTP in voorhersenen en hart mitochondriën in een pasgeboren muismodel van fragiel X-syndroom (FXS, Fmr1 knockout). We ontwikkelden een techniek om de spanningsdrempel voor mPTP-opening in deze mutante stam te bepalen, waarbij we gebruik maakten van de rol van de mPTP als protonlekkanaal.
Om dit te doen, werden zuurstofverbruik en membraanpotentiaal (ΔΨ) tegelijkertijd gemeten in geïsoleerde mitochondriën met behulp van polarografie en een tetrafenylfosfonium (TPP +) ionselectieve elektrode tijdens lekademhaling. De drempel voor mPTP-opening werd bepaald door het begin van CsA-gemedieerde remming van protonlekkage bij specifieke membraanpotentialen. Met behulp van deze benadering werden verschillen in spanningsgating van de mPTP nauwkeurig gedefinieerd in de context van CoQ-overmaat. Deze nieuwe techniek zal toekomstig onderzoek mogelijk maken voor het verbeteren van het begrip van fysiologische en pathologische regulatie van het openen van de mPTP met lage geleiding.
Introduction
De mPTP bemiddelt de permeabiliteitsovergang (PT), waarbij de IMM abrupt doorlaatbaar wordt voor kleine moleculen en lost 1,2 op. Dit opvallende fenomeen wijkt af van de karakteristieke ondoordringbaarheid van de IMM, die fundamenteel is voor het vaststellen van de elektrochemische gradiënt die nodig is voor oxidatieve fosforylering3. PT is, in tegenstelling tot andere mitochondriale transportmechanismen, een hooggeleidend, niet-specifiek en niet-selectief proces, waardoor de passage van een reeks moleculen tot 1,5 kDa 4,5 mogelijk is. De mPTP is een spanningsafhankelijk kanaal binnen de IMM waarvan de opening ΔΨ, ATP-productie, calciumhomeostase, reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie en cel levensvatbaarheid verandert4.
Aan het pathologische uiterste leidt ongecontroleerde en langdurige hooggeleidingsopening van mPTP tot de ineenstorting van de elektrochemische gradiënt, matrixzwelling, uitputting van matrixpyridinenucleotiden, buitenmembraanruptuur, afgifte van intermembraaneiwitten (inclusief cytochroom c) en uiteindelijk celdood 4,6. Een dergelijke pathologische mPTP-opening is betrokken bij cardiale ischemie-reperfusieletsel, hartfalen, traumatisch hersenletsel, verschillende neurodegeneratieve ziekten en diabetes 1,7. MPTP-opening met lage geleiding is echter fysiologisch van aard en leidt, in tegenstelling tot opening met hoge geleiding, niet tot diepgaande depolarisatie of mitochondriale zwelling4.
Lage geleidingsopening van de porie beperkt de permeabiliteit tot ~ 300 Da, maakt de passage van protonen onafhankelijk van ATP-synthese mogelijk en is een potentiële bron van fysiologisch protonlek5. Fysiologische mPTP-opening veroorzaakt een gecontroleerde afname van ΔΨ, verhoogt de elektronenflux door de ademhalingstransportketen en resulteert in een korte uitbarsting of flits van superoxide, wat bijdraagt aan ROS-signalering8. Regulatie van dergelijke voorbijgaande mPTP-opening is belangrijk voor calciumhomeostase en normale cellulaire ontwikkeling en rijping 4,9,10,11. Tijdelijke porieopening in zich ontwikkelende neuronen veroorzaakt bijvoorbeeld differentiatie, terwijl de sluiting van de mPTP rijping induceert in onrijpe cardiomyocyten 4,5.
Hoewel de functionele betekenis van de mPTP in gezondheid en ziekte goed is vastgesteld, blijft de precieze moleculaire identiteit ervan ter discussie staan. Vooruitgang met betrekking tot de moleculaire structuur en functie van het mPTP is elders uitgebreid besproken12. Kortom, momenteel worden hoog- en laaggeleidingstoestanden van de mPTP verondersteld te worden bemiddeld door verschillende entiteiten12. De belangrijkste kandidaten zijn de F1/F0 ATP-synthase (ATP-synthase) en adeninenucleotidetransporter (ANT) voor respectievelijk hoge en lage geleidingsmodi12.
Ondanks het gebrek aan consensus over de exacte identiteit van de porievormende component van de mPTP, zijn bepaalde belangrijke kenmerken gedetailleerd beschreven. Een goed ingeburgerd kenmerk van de mPTP is dat deze wordt gereguleerd door de elektrochemische gradiënt zodanig dat depolarisatie van de IMM leidt tot porieopening13. Eerder werk heeft aangetoond dat de redoxtoestand van vicinale thiolgroepen de spanningsgating van de mPTP verandert, zodanig dat oxidatie de porie opent bij relatief hogere ΔΨs, en thiolgroepreductie resulteert in gesloten mPTP-waarschijnlijkheid14. De identiteit van de eiwitspanningssensor is echter onbekend.
Verschillende kleine moleculen die de open waarschijnlijkheid van de porie moduleren, zijn geïdentificeerd. De mPTP kan bijvoorbeeld worden gestimuleerd om te openen met calcium, anorganisch fosfaat, vetzuren en ROS en kan worden geremd door adeninenucleotiden (met name ADP), magnesium, protonen en CsA 5,12. De werkingsmechanismen van sommige van deze regelgevers zijn opgehelderd. Mitochondriaal calcium veroorzaakt mPTP-opening ten minste gedeeltelijk door binding aan de β-subeenheid van het ATP-synthase15. ROS kan de mPTP activeren door de affiniteit voor ADP te verminderen en de affiniteit voor cyclofiline D (CypD), de best bestudeerde eiwitachtige mPTP-activator16, te verbeteren. Het mechanisme van activering van de mPTP door anorganisch fosfaat en vetzuren is minder duidelijk. Wat endogene remmers betreft, wordt gedacht dat ADP de mPTP remt door zich te binden aan de ANT- of ATP-synthase, terwijl magnesium zijn remmende effect uitoefent door calcium van zijn bindingsplaats te verdringen 15,17,18,19.
Lage pH remt mPTP-opening door histidine 112 van de regulerende oligomycinegevoeligheidsverlenende eiwit (OSCP) subeenheid van de ATP-synthase12,20,21 te protoneren. De prototypische farmacologische remmer van de mPTP, CsA, werkt door CypD te binden en de associatie met OSCP 22,23 te voorkomen. Eerder werk heeft ook aangetoond dat een verscheidenheid aan CoQ-analogen interageert met de mPTP, deze remt of activeert24. In recent werk vonden we bewijs van een pathologisch open mPTP, overmatig protonlek en inefficiënte oxidatieve fosforylering als gevolg van een CoQ-tekort aan voorhersenen mitochondriën van pasgeboren FXS-muizenpups25.
Sluiting van de porie met exogene CoQ blokkeerde het pathologische protonlek en veroorzaakte morfologische volwassenheid van dendritische stekels25. Interessant is dat FXS-cardiomyocyten bij dezelfde dieren overmatige CoQ-niveaus en gesloten mPTP-waarschijnlijkheid hadden in vergelijking met wildtypecontroles26. Hoewel de oorzaak van deze weefselspecifieke verschillen in CoQ-niveaus onbekend is, onderstrepen de bevindingen het concept dat endogene CoQ waarschijnlijk een belangrijke regulator van de mPTP is. Er is echter een grote lacune in onze kennis omdat het mechanisme van CoQ-gemedieerde remming van de mPTP onbekend blijft.
Regulatie van de mPTP is een kritische determinant van celsignalering en overleving4. Het detecteren van mPTP-opening in mitochondriën is dus de sleutel bij het overwegen van specifieke pathofysiologische mechanismen. Meestal wordt de drempel voor het openen van porieporiën met hoge geleiding bepaald met behulp van calcium om de permeabiliteitsovergang te activeren. Een dergelijke calciumbelasting leidt tot de ineenstorting van het membraanpotentiaal, snelle ontkoppeling van oxidatieve fosforylering en mitochondriale zwelling 27,28. We probeerden een methode te ontwikkelen om mPTP-openingen met lage geleiding in situ te detecteren, zonder dit per se te induceren.
De aanpak maakt gebruik van de rol van de mPTP als protonlekkanaal. Om dit te doen, werden Clark-Type en TPP + ionselectieve elektroden gebruikt om tegelijkertijd respectievelijk zuurstofverbruik en membraanpotentiaal te meten in geïsoleerde mitochondriën tijdens lekademhaling29. De drempel voor mPTP-opening werd bepaald door het begin van CsA-gemedieerde remming van protonlekkage bij specifieke membraanpotentialen. Met behulp van deze benadering werden verschillen in spanningsgating van de mPTP in de context van CoQ-overmaat nauwkeurig gedefinieerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode om de open waarschijnlijkheid van de mPTP te beoordelen. In het bijzonder werd de spanningsdrempel voor mPTP-opening met lage geleiding bepaald door het effect van CsA-remming op protonlekken over een bereik van ΔΨs te beoordelen. Met behulp van deze techniek konden we verschillen in spanningsgating van de mPTP tussen FXS-muizen en FVB-controles identificeren in overeenstemming met hun verschillen in weefselspecifieke CoQ-inhoud. Cruciaal voor het succes van deze methodologie is dat m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de volgende beurzen: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award aan de afdeling Anesthesiologie (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.), en NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
Referências
- Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
- Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
- Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W., Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).
- Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Biologia do Desenvolvimento. 426 (1), 1-7 (2017).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
- Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
- Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
- Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
- Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
- Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
- Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
- Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
- Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
- Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
- Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
- Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
- Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
- Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
- Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
- Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
- Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
- Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
- Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
- Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).
- Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
- Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).
- Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).
- Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
- Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
- Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).
