Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore im Setting des Coenzym-Q-Überschusses
Summary
Diese Methode nutzt den Beitrag der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zum Protonenleck mit niedriger Leitfähigkeit, um die Spannungsschwelle für die Porenöffnung bei neonatalen Fragile-X-Syndrom-Mäusen mit erhöhtem mitochondrialem Coenzym-Q-Gehalt im Vergleich zur Wildtypkontrolle zu bestimmen.
Abstract
Die mitochondriale Permeabilitätsübergangspore (mPTP) ist ein spannungsgesteuerter, nicht selektiver, innerer mitochondrialer Membran (IMM) Megakanal, der für Gesundheit und Krankheit wichtig ist. Das mPTP vermittelt das Austreten von Protonen über das IMM während der Öffnung mit niedriger Leitfähigkeit und wird spezifisch durch Cyclosporin A (CsA) gehemmt. Coenzym Q (CoQ) ist ein Regulator des mPTP, und gewebespezifische Unterschiede wurden im CoQ-Gehalt und in der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP in Vorderhirn- und Herzmitochondrien in einem neugeborenen Mausmodell des fragilen X-Syndroms (FXS, Fmr1-Knockout ) gefunden. Wir haben eine Technik entwickelt, um die Spannungsschwelle für die mPTP-Öffnung in diesem mutierten Stamm zu bestimmen, wobei wir die Rolle des mPTP als Protonenleckkanal ausnutzen.
Dazu wurden Sauerstoffverbrauch und Membranpotential (ΔΨ) gleichzeitig in isolierten Mitochondrien mittels Polarographie und einer Tetraphenylphosphonium (TPP+) ionenselektiven Elektrode während der Leckatmung gemessen. Der Schwellenwert für die mPTP-Öffnung wurde durch den Beginn der CsA-vermittelten Hemmung des Protonenlecks bei spezifischen Membranpotentialen bestimmt. Mit diesem Ansatz wurden Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP im Kontext des CoQ-Exzesses genau definiert. Diese neuartige Technik wird zukünftige Untersuchungen ermöglichen, um das Verständnis der physiologischen und pathologischen Regulation der Öffnung des mPTP mit niedriger Leitfähigkeit zu verbessern.
Introduction
Das mPTP vermittelt den Permeabilitätsübergang (PT), wobei das IMM abrupt durchlässig für kleine Moleküle und gelösteStoffe 1,2 wird. Dieses auffällige Phänomen ist eine deutliche Abkehr von der charakteristischen Undurchlässigkeit des IMM, die für die Bestimmung des für die oxidative Phosphorylierung notwendigen elektrochemischen Gradienten von grundlegender Bedeutung ist3. PT ist im Gegensatz zu anderen mitochondrialen Transportmechanismen ein unspezifisches und nichtselektives Verfahren mit hoher Leitfähigkeit, das die Passage einer Reihe von Molekülen bis zu 1,5 kDa 4,5 ermöglicht. Der mPTP ist ein spannungsgesteuerter Kanal innerhalb des IMM, dessen Öffnung ΔΨ, ATP-Produktion, Calciumhomöostase, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Zelllebensfähigkeit4 verändert.
Im pathologischen Extrem führt die unkontrollierte und verlängerte Öffnung von mPTP mit hoher Leitfähigkeit zum Kollaps des elektrochemischen Gradienten, zur Matrixschwellung, zum Abbau der Matrixpyridinnukleotide, zum äußeren Membranbruch, zur Freisetzung von Intermembranproteinen (einschließlich Cytochrom c) und schließlich zum Zelltod 4,6. Eine solche pathologische mPTP-Öffnung wurde mit Herzischämie-Reperfusionsverletzung, Herzinsuffizienz, traumatischer Hirnverletzung, verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und Diabetes 1,7 in Verbindung gebracht. Die mPTP-Öffnung mit niedrigem Leitwert ist jedoch physiologischer Natur und führt im Gegensatz zur Öffnung mit hoher Leitfähigkeit nicht zu einer tiefgreifenden Depolarisation oder mitochondrialen Schwellung4.
Die geringe Leitfähigkeitsöffnung der Pore schränkt die Permeabilität auf ~ 300 Da ein, ermöglicht die Passage von Protonen unabhängig von der ATP-Synthese und ist eine potenzielle Quelle für physiologisches Protonenleck5. Die physiologische mPTP-Öffnung verursacht einen kontrollierten Rückgang von ΔΨ, erhöht den Elektronenfluss durch die Atemtransportkette und führt zu einem kurzen Ausbruch oder Blitz von Superoxid, was zur ROS-Signalgebung8 beiträgt. Die Regulation einer solchen vorübergehenden mPTP-Öffnung ist wichtig für die Calciumhomöostase und die normale Zellentwicklung und -reifung 4,9,10,11. Die vorübergehende Porenöffnung in sich entwickelnden Neuronen löst beispielsweise eine Differenzierung aus, während der Verschluss des mPTP die Reifung in unreifen Kardiomyozyteninduziert 4,5.
Obwohl die funktionelle Bedeutung des mPTP für Gesundheit und Krankheit gut etabliert ist, bleibt seine genaue molekulare Identität umstritten. Die Fortschritte bei der molekularen Struktur und Funktion des mPTP wurden an anderer Stelleumfassend überprüft 12. Kurz gesagt, derzeit wurde angenommen, dass Hoch- und Niedrigleitfähigkeitszustände des mPTP durch verschiedene Entitätenvermittelt werden sollen 12. Die führenden Kandidaten sind die F1/F0-ATP-Synthase (ATP-Synthase) und der Adenin-Nukleotidtransporter (ANT) für Hoch- bzw. Low-Conductance-Modi12.
Trotz des fehlenden Konsenses über die genaue Identität der porenbildenden Komponente des mPTP wurden bestimmte Schlüsselmerkmale detailliert beschrieben. Ein etabliertes Merkmal des mPTP ist, dass es durch den elektrochemischen Gradienten so reguliert wird, dass die Depolarisation des IMM zur Porenöffnung13 führt. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass der Redoxzustand von vizinalen Thiolgruppen das Spannungsgating des mPTP so verändert, dass die Oxidation die Pore bei relativ höheren ΔΨs öffnet und die Reduktion der Thiolgruppe zu einer geschlossenen mPTP-Wahrscheinlichkeitvon 14 führt. Die Identität des proteinhaltigen Spannungssensors ist jedoch unbekannt.
Verschiedene kleine Moleküle, die die offene Wahrscheinlichkeit der Pore modulieren, wurden identifiziert. Zum Beispiel kann das mPTP stimuliert werden, sich mit Kalzium, anorganischem Phosphat, Fettsäuren und ROS zu öffnen und kann durch Adeninnukleotide (insbesondere ADP), Magnesium, Protonen und CsA 5,12 gehemmt werden. Die Wirkmechanismen einiger dieser Regulierungsbehörden wurden aufgeklärt. Mitochondriales Calcium löst die mPTP-Öffnung zumindest teilweise aus, indem es an die β-Untereinheit derATP-Synthase 15 bindet. ROS kann das mPTP aktivieren, indem es seine Affinität für ADP verringert und seine Affinität für Cyclophilin D (CypD), den am besten untersuchten proteinhaltigen mPTP-Aktivator16, erhöht. Der Mechanismus der Aktivierung des mPTP durch anorganisches Phosphat und Fettsäuren ist weniger klar. Bei endogenen Inhibitoren wird angenommen, dass ADP das mPTP durch Bindung an die ANT- oder ATP-Synthase hemmt, während Magnesium seine hemmende Wirkung ausübt, indem es Kalzium von seiner Bindungsstelle verdrängt15,17,18,19.
Ein niedriger pH-Wert hemmt die mPTP-Öffnung durch Protonierung von Histidin 112 der regulatorischen OSCP-Untereinheit (Oligomycin Sensitivity-Conferring Protein) der ATP-Synthase 12,20,21. Der prototypische pharmakologische Inhibitor des mPTP, CsA, wirkt, indem er CypD bindet und seine Assoziation mit OSCP22,23 verhindert. Frühere Arbeiten haben auch gezeigt, dass eine Vielzahl von CoQ-Analoga mit dem mPTP interagieren, es hemmen oder aktivieren24. In neueren Arbeiten fanden wir Hinweise auf ein pathologisch offenes mPTP, ein übermäßiges Protonenleck und eine ineffiziente oxidative Phosphorylierung aufgrund eines CoQ-Mangels in den Mitochondrien des Vorderhirns von neugeborenen FXS-Mauswelpen25.
Der Verschluss der Pore mit exogenem CoQ blockierte das pathologische Protonenleck und induzierte die morphologische Reife der dendritischen Stacheln25. Interessanterweise wiesen FXS-Kardiomyozyten bei denselben Tieren im Vergleich zu Wildtypkontrollen übermäßige CoQ-Spiegel und eine geschlossene mPTP-Wahrscheinlichkeit auf26. Obwohl die Ursache für diese gewebespezifischen Unterschiede in den CoQ-Spiegeln unbekannt ist, unterstreichen die Ergebnisse das Konzept, dass endogenes CoQ wahrscheinlich ein Schlüsselregulator des mPTP ist. Es gibt jedoch eine große Lücke in unserem Wissen, da der Mechanismus der CoQ-vermittelten Hemmung des mPTP unbekannt bleibt.
Die Regulation des mPTP ist eine kritische Determinante der Zellsignalisierung und des Überlebens4. Daher ist der Nachweis der mPTP-Öffnung in den Mitochondrien der Schlüssel zur Berücksichtigung spezifischer pathophysiologischer Mechanismen. Typischerweise wird der Schwellenwert für die Porenöffnung mit hoher Leitfähigkeit unter Verwendung von Kalzium bestimmt, um den Permeabilitätsübergang auszulösen. Eine solche Kalziumbelastung führt zum Kollaps des Membranpotentials, zur schnellen Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung und zur mitochondrialen Schwellung27,28. Wir haben versucht, eine Methode zu entwickeln, um die mPTP-Öffnung mit niedrigem Leitwert in situ nachzuweisen, ohne sie per se zu induzieren.
Der Ansatz nutzt die Rolle des mPTP als Protonenleckkanal aus. Zu diesem Zweck wurden Ionenselektivelektroden vom Clark-Typ und TPP+ verwendet, um gleichzeitig den Sauerstoffverbrauch bzw. das Membranpotential in isolierten Mitochondrien während der Leckatmung zu messen29. Der Schwellenwert für die mPTP-Öffnung wurde durch den Beginn der CsA-vermittelten Hemmung des Protonenlecks bei spezifischen Membranpotentialen bestimmt. Mit diesem Ansatz wurden Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP im Kontext des CoQ-Überschusses genau definiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP. Insbesondere wurde die Spannungsschwelle für die mPTP-Öffnung mit niedriger Leitfähigkeit bestimmt, indem die Wirkung der CsA-Hemmung auf das Protonenleck über einen Bereich von ΔΨs bewertet wurde. Mit dieser Technik konnten wir Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP zwischen FXS-Mäusen und FVB-Kontrollen identifizieren, die mit ihren Unterschieden im gewebespezifischen CoQ-Gehalt übereinstimmen. Entscheidend für de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award an die Abteilung für Anästhesiologie (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) und NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
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