Avaliação da Probabilidade Aberta do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial na Configuração do Coenzyme Q Excesso

Summary

Este método explora a contribuição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial para o vazamento de prótons de baixa condução para determinar o limiar de tensão para abertura de poros em camundongos neonatais frágeis da síndrome X com aumento do teor de coenzyme mitocondrial de cardiomiocrata Q em comparação com o controle do tipo selvagem.

Abstract

O pore de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) é um megacancanal de membrana mitocondrial interna (IMM) de tensão. O mPTP media o vazamento de prótons em todo o IMM durante a abertura de baixa condutância e é especificamente inibido pela ciclosporina A (CsA). Coenzyme Q (CoQ) é um regulador do mPTP, e diferenças específicas de tecido foram encontradas no conteúdo coq e probabilidade aberta do mPTP no cérebro e mitocôndrias cardíacas em um modelo de rato recém-nascido de síndrome X frágil (FXS, Fmr1 nocaute). Desenvolvemos uma técnica para determinar o limiar de tensão para abertura de mPTP nesta cepa mutante, explorando o papel do mPTP como um canal de vazamento de prótons.

Para isso, o consumo de oxigênio e o potencial de membrana (ΔΦ) foram medidos simultaneamente em mitocôndrias isoladas usando polarografia e um eletrodo seletivo de íons (TPP⁺) durante a respiração do vazamento. O limiar para abertura de MPTP foi determinado pelo início da inibição mediada por CsA do vazamento de prótons em potenciais específicos da membrana. Utilizando essa abordagem, as diferenças na tensão do mPTP foram precisamente definidas no contexto do excesso de CoQ. Esta nova técnica permitirá futura investigação para aprimorar a compreensão da regulação fisiológica e patológica da abertura de baixa condutura do MPTP.

Introduction

O mPTP media a transição de permeabilidade (PT), pela qual o IMM torna-se abruptamente permeável para pequenas moléculas e solutos ^1,2. Este fenômeno marcante é uma partida distinta da impermeabilidade característica do IMM, que é fundamental para o estabelecimento do gradiente eletroquímico necessário para a fosforilação oxidativa³. Pt, ao contrário de outros mecanismos de transporte mitocondrial, é um processo de alta condução, não específico e não seletivo, permitindo a passagem de uma gama de moléculas de até 1,5 kDa ^4,5. O mPTP é um canal fechado de tensão dentro do IMM cuja abertura altera ΔΦ, produção de ATP, homeostase de cálcio, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e viabilidade celular⁴.

No extremo patológico, a abertura de alta condutância patológica e prolongada de mPTP leva ao colapso do gradiente eletroquímico, inchaço matricial, esgotamento de nucleotídeos matriciais de piridina, ruptura da membrana externa, liberação de proteínas intermembranas (incluindo citocromo c), e, finalmente, morte celular ^4,6. Essa abertura patológica de MPTP foi implicada em lesão de isquemia cardíaca- reperfusão, insuficiência cardíaca, lesão cerebral traumática, várias doenças neurodegenerativas e diabetes ^1,7. No entanto, a abertura de MPTP de baixa condução é de natureza fisiológica e, ao contrário da abertura de alta condução, não leva a uma profunda despolarização ou inchaço mitocondrial⁴.

A abertura de baixa condução do poro restringe a permeabilidade a ~300 Da, permite a passagem de prótons independentes da síntese de ATP, e é uma fonte potencial de vazamento fisiológico de^{prótons 5}. A abertura fisiológica de MPTP causa um declínio controlado em ΔΦ, aumenta o fluxo de elétrons através da cadeia de transporte respiratório, e resulta em uma pequena explosão ou flash de superóxido, contribuindo para a sinalização ROS⁸. A regulação dessa abertura transitória de MPTP é importante para a homeostase de cálcio e desenvolvimento celular normal e maturação^de 4,9,10,11. A abertura transitória de poros no desenvolvimento de neurônios, por exemplo, desencadeia diferenciação, enquanto o fechamento do mPTP induz o amadurecimento em cardiomiócitos imaturos ^4,5.

Embora a significância funcional do PMP em saúde e doença seja bem estabelecida, sua identidade molecular precisa permanece debatida. O progresso na estrutura molecular e na função do MPTP foi amplamente revisto em outros lugares¹². Resumidamente, atualmente, os estados de alta e baixa condução do MPTP têm sido considerados mediados por entidades distintas¹². Os principais candidatos são o ATP de F1/F0 synthase (ATP synthase) e o transporte de nucleotídeos de adenina (ANT) para modos de alta e baixa condução, respectivamente¹².

Apesar da falta de consenso quanto à identidade exata do componente formador de poros do MPTP, algumas características-chave foram detalhadas. Uma característica bem estabelecida do mPTP é que ele é regulado pelo gradiente eletroquímico de tal forma que a despolarização do IMM leva à abertura de poros¹³. Trabalhos anteriores mostraram que o estado redox dos grupos de thiol vicinal altera a tensão do mPTP, de tal forma que a oxidação abre o poro em ΔΦs relativamente maior, e a redução do grupo thiol resulta na probabilidade de mPTP¹⁴. No entanto, a identidade do sensor de tensão proteinácea é desconhecida.

Várias pequenas moléculas que modulam a probabilidade aberta do poro foram identificadas. Por exemplo, o mPTP pode ser estimulado a abrir com cálcio, fosfato inorgânico, ácidos graxos e ROS e pode ser inibido por nucleotídeos de adenina (particularmente ADP), magnésio, prótons e CsA ^5,12. Os mecanismos de ação de alguns desses reguladores foram elucidados. O cálcio mitocondrial desencadeia a abertura do MPTP pelo menos em parte, vinculando-se à subunidade β do ATP synthase¹⁵. A ROS pode ativar o mPTP diminuindo sua afinidade com a ADP e aumentando sua afinidade com a ciclofilina D (CypD), o ativador mPTP proteináceo mais bem estudado¹⁶. O mecanismo de ativação do mPTP por fosfato inorgânico e ácidos graxos é menos claro. Quanto aos inibidores endógenos, acredita-se que a ADP iniba o mPTP por vinculação na ant ou atp synthase, enquanto o magnésio exerce seu efeito inibidor deslocando o cálcio de seu local de ligação 15,17,18,19.

O pH baixo inibe a abertura de mPTP protonando histidina 112 da subunidade de proteína de sensibilidade à oligomicina regulatória (OSCP) da ATP synthase 12,20,21. O prototípico inibidor farmacológico do mPTP, CsA, atua por vinculação de CypD e impedindo sua associação com a OSCP^22,23. Trabalhos anteriores também mostraram que uma variedade de análogos de CoQ interagem com o mPTP, inibindo-o ou ativando-o²⁴. Em trabalhos recentes, encontramos evidências de um mPTP patologicamente aberto, vazamento excessivo de prótons e fosforilação oxidativa ineficiente devido a uma deficiência de CoQ em mitocôndrias de cérebros de filhotes de camundongos FXS recém-nascidos²⁵.

O fechamento do poro com CoQ exógeno bloqueou o vazamento patológico de prótons e induziu a maturidade morfológica das espinhas dendríticas²⁵. Curiosamente, nos mesmos animais, os cardiomiócitos FXS apresentaram níveis excessivos de CoQ e probabilidade de MPTP fechado em comparação com os controles do tipo selvagem²⁶. Embora a causa dessas diferenças específicas do tecido nos níveis de CoQ seja desconhecida, os achados ressaltam o conceito de que o CoQ endógeno é provavelmente um regulador-chave do mPTP. No entanto, há uma grande lacuna em nosso conhecimento porque o mecanismo de inibição mediada pelo CoQ do MPTP permanece desconhecido.

A regulação do MPTP é um determinante crítico da sinalização celular e sobrevivência⁴. Assim, detectar a abertura de MPTP dentro das mitocôndrias é fundamental quando se considera mecanismos fisiodicos específicos. Normalmente, o limiar para abertura de poros de alta condução é determinado usando cálcio para desencadear a transição de permeabilidade. Esse carregamento de cálcio leva ao colapso do potencial da membrana, ao desacoplamento rápido da fosforilação oxidativa e ao inchaço mitocondrial^27,28. Buscamos desenvolver um método para detectar abertura de MPTP de baixa condução in situ, sem induzi-la por si só.

A abordagem explora o papel do mPTP como um canal de vazamento de prótons. Para isso, foram empregados eletrodos seletivos Clark-Type e TPP⁺ para medir simultaneamente o consumo de oxigênio e o potencial da membrana, respectivamente, em mitocôndrias isoladas durante a respiração^{do vazamento 29}. O limiar para abertura de MPTP foi determinado pelo início da inibição mediada por CsA do vazamento de prótons em potenciais específicos da membrana. Utilizando essa abordagem, foram precisamente definidas as diferenças de tensão do mPTP no contexto do excesso de CoQ.

Protocol

A aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Columbia foi obtida para todos os métodos descritos. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) e controle (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) foram adquiridos comercialmente (ver a Tabela dos Materiais). Cinco a onze animais foram utilizados em cada grupo experimental. Ratos pós-natal 10 (P10) foram usados para modelar por um po…

Representative Results

São mostradas as curvas típicas de consumo O2 e ΔΦ geradas nesses experimentos (Figura 1A,B). O declínio logarítmico no sinal de tensão com calibração TPP+ é mostrado no início de cada experimento. A ausência deste padrão logarítmico pode sugerir um problema com o eletrodo seletivo TPP+. Mitocôndrias normalmente geram ΔΦ imediatamente após a adição ao tampão respiratório. ΔΦ pode ser interpretado a partir de alteraçõ…

Discussion

Este artigo descreve um método para avaliar a probabilidade aberta do mPTP. Especificamente, o limiar de tensão para abertura de mPTP de baixa condução foi determinado pela avaliação do efeito da inibição de CsA no vazamento de prótons sobre uma gama de ΔΦs. Usando esta técnica, pudemos identificar diferenças na tensão do mPTP entre camundongos FXS e controles FVB consistentes com suas diferenças no conteúdo coQ específico do tecido. Fundamental para o sucesso dessa metodologia é que as mitocôndrias s?…

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1	PP systems	941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft.	Fisher Scientific	14-170-11B	to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free	Sigma	A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FXS mice, Fmr1 KO
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk	Cole-Parmer	EW-07938-30	microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle	Cole-Parmer	EW-07938-02	microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete	PP systems	OXYTHERM+R	oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Sigma	P1644	medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Sucrose	Sigma	S0389
TPP+ Electrode Tips (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP