Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi
Summary
Bu yöntem, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlikli proton sızıntısına katkısından, vahşi tip kontrolüne kıyasla artmış kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğine sahip yenidoğan kırılgan X sendromlu farelerde gözenek açılması için voltaj eşiğini belirlemek için kullanır.
Abstract
Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri (mPTP), sağlık ve hastalıkta önemli olan voltaj kapılı, seçici olmayan, iç mitokondriyal membran (IMM) mega kanalıdır. mPTP, düşük iletkenlikli açıklık sırasında IMM boyunca protonların sızmasına aracılık eder ve özellikle siklosporin A (CsA) tarafından inhibe edilir. Koenzim Q (CoQ), mPTP’nin bir düzenleyicisidir ve CoQ içeriğinde dokuya özgü farklılıklar ve kırılgan X sendromunun (FXS, Fmr1 nakavtı) yenidoğan bir fare modelinde ön beyin ve kalp mitokondrisinde mPTP’nin açık olasılığı bulunmuştur. Bu mutant suşta mPTP açıklığı için voltaj eşiğini belirlemek için bir teknik geliştirdik ve mPTP’nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlandık.
Bunu yapmak için, oksijen tüketimi ve membran potansiyeli (ΔΨ), polarografi ve sızıntı solunumu sırasında bir tetrafenilfosfonyum (TPP +) iyon seçici elektrot kullanılarak izole mitokondride eşzamanlı olarak ölçülmüştür. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, mPTP’nin voltaj geçişindeki farklılıklar, CoQ fazlalığı bağlamında kesin olarak tanımlanmıştır. Bu yeni teknik, mPTP’nin düşük iletkenlikli açılmasının fizyolojik ve patolojik düzenlemesinin anlaşılmasını arttırmak için gelecekteki araştırmalara izin verecektir.
Introduction
mPTP, geçirgenlik geçişine (PT) aracılık eder, böylece İBB aniden küçük moleküllere geçirgen hale gelir ve 1,2’yi çözündürür. Bu çarpıcı fenomen, oksidatif fosforilasyon için gerekli elektrokimyasal gradyanı belirlemek için temel olan İBB’nin karakteristik geçirimsizliğinden belirgin bir sapmadır3. PT, diğer mitokondriyal taşıma mekanizmalarının aksine, 1.5 kDa 4,5’e kadar bir molekül aralığının geçişine izin veren, yüksek iletkenlikli, spesifik olmayan ve seçici olmayan bir işlemdir. mPTP, açıklığı ΔΨ, ATP üretimi, kalsiyum homeostazı, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi ve hücre canlılığı4’ü değiştiren IMM içindeki voltaj kapılı bir kanaldır.
mPTP’nin patolojik aşırılıkta, kontrolsüz ve uzun süreli yüksek iletkenlikli açıklığı, elektrokimyasal gradyanın çökmesine, matris şişmesine, matriks piridin nükleotitlerinin tükenmesine, dış zar rüptürüne, membranlar arası proteinlerin salınmasına (sitokrom c dahil) ve nihayetinde hücre ölümüne yol açar 4,6. Bu patolojik mPTP açıklığı kardiyak iskemi-reperfüzyon hasarı, kalp yetmezliği, travmatik beyin hasarı, çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ve diyabet 1,7 ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı doğada fizyolojiktir ve yüksek iletkenlikli açıklığın aksine, derin depolarizasyona veya mitokondriyal şişmeye yol açmaz4.
Gözeneklerin düşük iletkenlik açıklığı, geçirgenliği ~ 300 Da ile sınırlar, protonların ATP sentezinden bağımsız geçişine izin verir ve fizyolojik proton sızıntısı5’in potansiyel bir kaynağıdır. Fizyolojik mPTP açıklığı, ΔΨ’de kontrollü bir düşüşe neden olur, solunum taşıma zinciri boyunca elektron akışını arttırır ve kısa bir süperoksit patlaması veya parlaması ile sonuçlanır, bu da ROS sinyallemesine katkıda bulunur8. Bu tür geçici mPTP açıklığının düzenlenmesi kalsiyum homeostazı ve normal hücresel gelişim ve olgunlaşma 4,9,10,11 için önemlidir. Örneğin, gelişmekte olan nöronlarda geçici gözenek açıklığı farklılaşmayı tetiklerken, mPTP’nin kapanması olgunlaşmamış kardiyomiyositlerde olgunlaşmayı indükler 4,5.
mPTP’nin sağlık ve hastalıktaki fonksiyonel önemi iyi kurulmuş olmasına rağmen, kesin moleküler kimliği tartışılmaya devam etmektedir. mPTP’nin moleküler yapısı ve işlevi konusundaki ilerleme, başka yerlerde kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir12. Kısaca, şu anda, mPTP’nin yüksek ve düşük iletkenlik durumlarının, farklı varlıklar tarafından aracılık edildiği varsayılmıştır12. Önde gelen adaylar, sırasıyla yüksek ve düşük iletkenlik modları için F1 / F0 ATP sentaz (ATP sentaz) ve adenin nükleotid taşıyıcısıdır (ANT), 12.
mPTP’nin gözenek oluşturan bileşeninin tam kimliği konusunda fikir birliği olmamasına rağmen, bazı temel özellikler detaylandırılmıştır. mPTP’nin iyi bilinen bir özelliği, elektrokimyasal gradyan tarafından düzenlenmesidir, böylece İBB’nin depolarizasyonu gözenek açılmasına yol açar13. Önceki çalışmalar, vicinal tiol gruplarının redoks durumunun, mPTP’nin voltaj geçidini değiştirdiğini, böylece oksidasyonun gözenekleri nispeten daha yüksek ΔΨ’lerde açtığını ve tiol grubu azalmasının kapalı mPTP olasılığı14 ile sonuçlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, proteinli voltaj sensörünün kimliği bilinmemektedir.
Gözeneklerin açık olasılığını modüle eden çeşitli küçük moleküller tanımlanmıştır. Örneğin, mPTP kalsiyum, inorganik fosfat, yağ asitleri ve ROS ile açılmaya teşvik edilebilir ve adenin nükleotidleri (özellikle ADP), magnezyum, protonlar ve CsA 5,12 tarafından inhibe edilebilir. Bu düzenleyicilerin bazılarının etki mekanizmaları açıklığa kavuşturulmuştur. Mitokondriyal kalsiyum, ATP sentaz15’in β alt birimine bağlanarak mPTP açılımını en azından kısmen tetikler. ROS, ADP’ye olan afinitesini azaltarak ve en iyi çalışılmış proteinli mPTP aktivatörü16 olan siklofilin D (CypD) için afinitesini artırarak mPTP’yi aktive edebilir. mPTP’nin inorganik fosfat ve yağ asitleri tarafından aktivasyon mekanizması daha az açıktır. Endojen inhibitörlere gelince, ADP’nin ANT veya ATP sentazına bağlanarak mPTP’yi inhibe ettiği düşünülürken, magnezyum kalsiyumu bağlanma bölgesinden 15,17,18,19 yerinden oynatarak inhibitör etkisini gösterir.
Düşük pH, ATP sentaz 12,20,21’in düzenleyici oligomisin duyarlılığı veren protein (OSCP) alt biriminin histidin112’sini protonlayarak mPTP açılmasını inhibe eder. mPTP’nin prototipik farmakolojik inhibitörü CsA, CypD’yi bağlayarak ve OSCP22,23 ile ilişkisini önleyerek etki eder. Önceki çalışmalar ayrıca çeşitli CoQ analoglarının mPTP ile etkileşime girdiğini, onu inhibe ettiğini veya24’ü aktive ettiğini göstermiştir. Son çalışmalarda, patolojik olarak açık bir mPTP, aşırı proton sızıntısı ve yenidoğan FXS fare yavrularının ön beyin mitokondrisinde CoQ eksikliğine bağlı olarak verimsiz oksidatif fosforilasyonun kanıtlarını bulduk25.
Gözeneklerin eksojen CoQ ile kapatılması patolojik proton sızıntısını bloke etti ve dendritik dikenlerin morfolojik olgunluğunu indükledi25. İlginç bir şekilde, aynı hayvanlarda, FXS kardiyomiyositleri aşırı CoQ seviyelerine sahipti ve wildtype kontrolleri26’ya kıyasla mPTP olasılığını kapattı. CoQ seviyelerindeki bu dokuya özgü farklılıkların nedeni bilinmemekle birlikte, bulgular endojen CoQ’nun muhtemelen mPTP’nin önemli bir düzenleyicisi olduğu kavramını vurgulamaktadır. Bununla birlikte, bilgimizde büyük bir boşluk vardır, çünkü mPTP’nin CoQ aracılı inhibisyon mekanizması bilinmemektedir.
mPTP’nin düzenlenmesi, hücre sinyalizasyonu ve sağkalımının kritik bir belirleyicisidir4. Bu nedenle, mitokondri içinde mPTP açıklığının saptanması, spesifik patofizyolojik mekanizmalar göz önüne alındığında anahtardır. Tipik olarak, yüksek iletkenlikli gözenek açma eşiği, geçirgenlik geçişini tetiklemek için kalsiyum kullanılarak belirlenir. Bu tür kalsiyum yüklemesi, membran potansiyelinin çökmesine, oksidatif fosforilasyonun hızlı bir şekilde ayrılmasına ve mitokondriyal şişmeye yol açar27,28. Düşük iletkenlikli mPTP açıklığını kendi başına indüklemeden in situ olarak tespit etmek için bir yöntem geliştirmeye çalıştık.
Yaklaşım, mPTP’nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlanır. Bunu yapmak için, Clark-Tipi ve TPP + iyon seçici elektrotlar, sızıntı solunumu sırasında izole mitokondride sırasıyla oksijen tüketimini ve membran potansiyelini aynı anda ölçmek için kullanıldı29. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, CoQ fazlalığı bağlamında mPTP’nin voltaj geçidindeki farklılıklar kesin olarak tanımlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda mPTP’nin açık olasılığını değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Spesifik olarak, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı için voltaj eşiği, CsA inhibisyonunun bir dizi ΔΨ üzerindeki proton sızıntısı üzerindeki etkisinin değerlendirilmesiyle belirlendi. Bu tekniği kullanarak, FXS fareleri ve FVB kontrolleri arasındaki mPTP’nin voltaj geçişindeki farklılıkları, dokuya özgü CoQ içeriğindeki farklılıklarıyla tutarlı olarak tanımlayabiliriz. Bu metodolojinin başa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmektedir: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia Üniversitesi Irving Tıp Merkezi Anesteziyoloji Bölümü’ne Fırsat Provost Hedefi Ödülü (K.K.G.), Pediatrik Anestezi Derneği Genç Araştırmacı Araştırma Ödülü (K.K.G.) ve NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
Referências
- Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
- Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
- Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W., Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).
- Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Biologia do Desenvolvimento. 426 (1), 1-7 (2017).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
- Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
- Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
- Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
- Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
- Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
- Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
- Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
- Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
- Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
- Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
- Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
- Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
- Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
- Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
- Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
- Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
- Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
- Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
- Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).
- Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
- Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).
- Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).
- Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
- Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
- Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).
