Denne metoden utnytter bidraget fra mitokondriell permeabilitetsporering til protonlekkasje med lav ledning for å bestemme spenningsterskelen for poreåpning hos neonatale skjøre X syndrommus med økt kardiomyyocytt mitokondrie coenzyme Q-innhold sammenlignet med wildtype-kontroll.
Mitokondriepermeabilitetsporering (mPTP) er en spenningsportert, ikke-selektiv, indre mitokondriemembran (IMM) megakanal som er viktig for helse og sykdom. mPTP formidler lekkasje av protoner over IMM under åpning med lav ledningsevne og er spesielt hemmet av ciklosporin A (CsA). Coenzyme Q (CoQ) er en regulator av mPTP, og vevsspesifikke forskjeller har blitt funnet i CoQ-innhold og åpen sannsynlighet for mPTP i forebrain og hjerte mitokondrier i en nyfødt musemodell av skjøre X syndrom (FXS, Fmr1 knockout). Vi utviklet en teknikk for å bestemme spenningsterskelen for mPTP-åpning i denne mutantstammen, og utnytte rollen som mPTP som en protonlekkasjekanal.
For å gjøre dette ble oksygenforbruk og membranpotensial (ΔΨ) samtidig målt i isolert mitokondrier ved hjelp av polarografi og et tetrafenylfosfonium (TPP +) ion-selektiv elektrode under lekkasje respirasjon. Terskelen for mPTP-åpning ble bestemt ved utbruddet av CsA-mediert hemming av protonlekkasje ved spesifikke membranpotensialer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble forskjeller i spenningsgambling av mPTP nøyaktig definert i sammenheng med CoQ-overskudd. Denne nye teknikken vil tillate fremtidig undersøkelse for å forbedre forståelsen av fysiologisk og patologisk regulering av lavledningsåpning av mPTP.
mPTP formidler permeabilitetsovergangen (PT), der IMM brått blir gjennomtrengelig for små molekyler og løsemidler 1,2. Dette slående fenomenet er et tydelig avvik fra IMM’s karakteristiske impermeabilitet, noe som er grunnleggende for å etablere den elektrokjemiske gradienten som er nødvendig for oksidativ fosforylering3. PT, i motsetning til andre mitokondrietransportmekanismer, er en høylednings-, ikke-spesifikk og ikke-selektiv prosess, slik at passasjen av en rekke molekyler opp til 1,5 kDa 4,5. mPTP er en spenningsportert kanal i IMM hvis åpning endrer ΔΨ, ATP-produksjon, kalsium homeostase, reaktiv oksygenarter (ROS) produksjon og celle levedyktighet4.
Ved den patologiske ekstreme, ukontrollerte og langvarige høyledningsåpningen av mPTP fører til sammenbrudd av den elektrokjemiske gradienten, matrise hevelse, uttømming av matrise pyridin nukleotider, ytre membranbrudd, frigjøring av intermembrane proteiner (inkludert cytokrom c), og til slutt celledød 4,6. Slik patologisk mPTP-åpning har vært involvert i hjerte-iskemi-reperfusjonsskade, hjertesvikt, traumatisk hjerneskade, ulike nevrodegenerative sykdommer og diabetes 1,7. Imidlertid er lavlednings mPTP-åpning fysiologisk i naturen, og i motsetning til høyledningsåpning fører det ikke til dyp depolarisering eller mitokondrie hevelse4.
Lavledningsåpning av poren begrenser permeabiliteten til ~ 300 Da, tillater passasje av protoner uavhengig av ATP-syntese, og er en potensiell kilde til fysiologisk protonlekkasje5. Fysiolog mPTP-åpning forårsaker en kontrollert nedgang i ΔΨ, øker elektronstrømmen gjennom luftveiene i transportkjeden, og resulterer i en kort utbrudd eller blits av superoksid, noe som bidrar til ROS-signalering8. Regulering av slik forbigående mPTP-åpning er viktig for kalsium homeostase og normal cellulær utvikling og modning 4,9,10,11. Forbigående poreåpning i utvikling av nevroner utløser for eksempel differensiering, mens lukkingen av mPTP induserer modning i umodne kardiomyocytter 4,5.
Selv om den funksjonelle betydningen av mPTP i helse og sykdom er godt etablert, forblir den nøyaktige molekylære identiteten debattert. Fremdriften på mPTPs molekylære struktur og funksjon er grundig gjennomgått andre steder12. Kort sagt, for tiden har høy- og lavledningstilstander av mPTP blitt hypoteset om å bli formidlet av forskjellige enheter12. De ledende kandidatene er F1/F0 ATP syntase (ATP syntase) og adenin nukleotidtransportør (ANT) for høy- og lavledningsmodus, henholdsvis12.
Til tross for mangel på konsensus om den eksakte identiteten til den poredannende komponenten i mPTP, har visse nøkkelegenskaper blitt detaljert. Et veletablert trekk ved mPTP er at den er regulert av den elektrokjemiske gradienten slik at depolarisering av IMM fører til poreåpning13. Tidligere arbeid har vist at redokstilstanden til vicinal tiolgrupper endrer spenningsstrømmingen av mPTP, slik at oksidasjon åpner poren ved relativt høyere ΔΨs, og thiolgruppereduksjon resulterer i lukket mPTP-sannsynlighet14. Identiteten til den proteinholdige spenningssensoren er imidlertid ukjent.
Ulike små molekyler som modulerer porens åpne sannsynlighet er identifisert. For eksempel kan mPTP stimuleres til å åpne med kalsium, uorganisk fosfat, fettsyrer og ROS og kan hemmes av adeninkjerner (spesielt ADP), magnesium, protoner og CsA 5,12. Virkningsmekanismene til noen av disse regulatorene har blitt belyst. Mitokondriekalsium utløser mPTP-åpning i det minste delvis ved å binde seg til β-underenheten til ATP-syntasen15. ROS kan aktivere mPTP ved å redusere affiniteten for ADP og forbedre affiniteten for cyklofilin D (CypD), den best studerte proteinholdige mPTP-aktivatoren16. Aktiveringsmekanismen for mPTP ved uorganisk fosfat og fettsyrer er mindre klar. Når det gjelder endogene hemmere, antas ADP å hemme mPTP ved binding ved ANT- eller ATP-syntase, mens magnesium utøver sin hemmende effekt ved å fortrenge kalsium fra bindingsstedet 15,17,18,19.
Lav pH hemmer mPTP-åpning ved å protonere histidin 112 av den regulatoriske oligomycinfølsomhetsgivende protein (OSCP) subenheten til ATP-syntasen 12,20,21. Den prototypiske farmakologiske hemmeren av mPTP, CsA, virker ved å binde CypD og forhindre dens tilknytning til OSCP22,23. Tidligere arbeid har også vist at en rekke CoQ-analoger samhandler med mPTP, hemmer det eller aktiverer det24. I nyere arbeid fant vi bevis på en patologisk åpen mPTP, overdreven protonlekkasje og ineffektiv oksidativ fosforylering på grunn av en CoQ-mangel i forebrain mitokondrier av nyfødte FXS-musevalper25.
Lukking av poren med eksogen CoQ blokkerte den patologiske protonlekkasjen og induserte morfologiske modenhet av dendrittiske spines25. Interessant nok, i de samme dyrene, hadde FXS kardiomyocytter overdreven CoQ-nivåer og lukket mPTP-sannsynlighet sammenlignet med wildtype-kontroller26. Selv om årsaken til disse vevsspesifikke forskjellene i CoQ-nivåer er ukjent, understreker funnene konseptet om at endogen CoQ sannsynligvis er en nøkkelregulator for mPTP. Imidlertid er det et stort gap i vår kunnskap fordi mekanismen for CoQ-mediert hemming av mPTP forblir ukjent.
Regulering av mPTP er en kritisk determinant for cellesignalering og overlevelse4. Dermed er det viktig å oppdage mPTP-åpning innen mitokondrier når man vurderer spesifikke patofysiologiske mekanismer. Vanligvis bestemmes terskelen for poreåpning med høy ledning ved hjelp av kalsium for å utløse permeabilitetsovergangen. Slik kalsiumbelastning fører til sammenbrudd av membranpotensialet, rask frakobling av oksidativ fosforylering og mitokondrie hevelse27,28. Vi forsøkte å utvikle en metode for å oppdage mPTP-åpning med lav ledning in situ, uten å indusere den i seg selv.
Tilnærmingen utnytter rollen til mPTP som en protonlekkasjekanal. For å gjøre dette ble Clark-Type og TPP+ ion-selektive elektroder brukt til samtidig å måle oksygenforbruk og membranpotensial, henholdsvis i isolerte mitokondrier under lekkasje respirasjon29. Terskelen for mPTP-åpning ble bestemt ved utbruddet av CsA-mediert hemming av protonlekkasje ved spesifikke membranpotensialer. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble forskjeller i spenningsgambling av mPTP i sammenheng med CoQ-overskudd nøyaktig definert.
Dette dokumentet beskriver en metode for å vurdere den åpne sannsynligheten for mPTP. Spesielt ble spenningsterskelen for mPTP-åpning med lav ledning bestemt ved å vurdere effekten av CsA-hemming på protonlekkasje over en rekke ΔΨs. Ved hjelp av denne teknikken kunne vi identifisere forskjeller i spenningsgambling av mPTP mellom FXS-mus og FVB-kontroller i samsvar med deres forskjeller i vevsspesifikt CoQ-innhold. Kritisk for suksessen til denne metoden er at mitokondrier er nyisolert før bruk og er av god kvalit…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av følgende tilskudd: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award til Institutt for anestesiologi (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) og NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.G.)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |