マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養
Summary
マウス網膜から得られたミュラーグリア初代培養物は、マイクロRNA処理後の網膜前駆細胞へのグリア変換を研究するための非常に堅牢で信頼性の高いツールです。単一分子または組み合わせは、 その後のin vivo アプローチの適用前に試験することができる。
Abstract
ミュラーグリア(MG)は、神経網膜における優勢なグリアであり、網膜ニューロンの再生源として機能することができる。魚などの低脊椎動物では、MG駆動の再生が自然に起こります。しかし、哺乳類では、特定の要因による刺激または遺伝的/エピジェネティックな操作が必要です。MGは網膜細胞集団のわずか5%しか含まないので、この細胞集団の研究を排他的に可能にするモデル系が必要である。これらのモデルシステムの1つは、再現性があり、分子/因子のスクリーニングおよび同定、化合物または因子の試験、細胞モニタリング、および/または機能試験を含む様々な用途に使用できる一次MG培養物である。このモデルは、人工miRNAまたはその阻害剤のトランスフェクション を介して マイクロRNA(miRNA)の補充または阻害後に網膜ニューロンに変換するマウスMGの可能性を研究するために使用される。MG特異的レポーターマウスを免疫蛍光標識および単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)と組み合わせて使用することにより、これらの培養物に見られる細胞の80%〜90%がMGであることを確認した。 このモデルを使用して、miRNAがMGを網膜前駆細胞(RPC)に再プログラムし、その後ニューロン様細胞に分化できることが発見された。この技術の利点は、miRNA候補を in vivoアプリケーションで使用する 前に、その効率と結果についてテストできることです。
Introduction
ミュラーグリア(MG)は、神経網膜における優勢なグリアである。それらは、水とイオンの恒常性の維持、ニューロンの栄養補給、組織の保護など、中枢神経系の他の部分の他のグリアと比較して同様の機能を有する。MGにはもう一つの魅力的な特徴があります:成熟したグリアですが、発達後期に網膜前駆細胞(RPC)で発現する多くの遺伝子を発現しています1,2。この類似性は、網膜損傷後の魚網膜における天然に存在するMGベースのニューロン再生の理由であると仮定される3,4。このプロセスの間、MGは細胞周期に再突入し、RPCに脱分化し、その後、6種類の網膜ニューロンすべてに分化する。この現象は魚類では自然に起こるが、哺乳類のMGはニューロン5,6に変換されない。ただし、再プログラムすることはできます。MGをRPC/ニューロンに再プログラムする様々な要因が示されている。これらの因子の中には、魚の再生に関与する基本的なヘリックス・ループ・ヘリックス(bHLH)転写因子アカイテ・スキュートホモログ1(Ascl1)がある7,8。マウスでは、Ascl1は網膜形成中にRPCでのみ発現するが、成熟MGまたは網膜ニューロン9には存在しない。
インビボで細胞を直接リプログラミングすることは、方法論的に難しいだけでなく、施設の動物ケアおよび使用委員会からの承認も必要とします。承認を受けるには、使用または変更された因子、濃度、オフターゲット効果、根底にあるメカニズム、毒性、および効率に関する予備データが必要です。細胞培養システムは、in vivoモデルでの使用前にこれらの基準を試験することを可能にする。さらに、MGは網膜細胞集団10全体の約5%しか占めていないので、MG培養物は、遊走12、13、増殖14、傷害/損傷に対するストレス反応15、16、ミクログリア17または網膜神経節細胞(RGC)などの他の細胞型との相互作用を含む、それらの機能11ならびにそれらの挙動の研究を可能にする18、 またはそれらの神経原性潜在能力19、20、21。多くの研究者は、無限の増殖性を有し、容易に維持およびトランスフェクトすることができるため、不死化細胞株を研究に使用している。しかし、初代細胞は、真の細胞特性(遺伝子およびタンパク質の発現)を有し、さらに重要なことに、それらは発達の特定の段階を表し、したがって「年齢」を有するため、不死化細胞よりも生物学的に関連するアッセイに好ましい。動物の年齢(そしてその結果として動物から得られた細胞の年齢)は、細胞の可塑性が発達段階の進行とともに減少するため、細胞のリプログラミングにおいて特に重要な要素である22。
このプロトコルは、再生を研究するための現在の in vitro 法として、miRNAで原発性MGを再プログラムする方法を詳細に説明しています。このMG初代培養モデルは、P53ノックアウトマウス(trp53-/-マウス)におけるMGの細胞増殖特性を評価するために2012年に設立されました23。培養MGはグリアの特徴(すなわち、免疫蛍光標識 を介して 評価されたS100β、Pax6、およびSox2タンパク質の発現)を維持し、 in vivo MG(FACS精製MGのマイクロアレイ)に類似していることが示された23。その後まもなく、グリアmRNAおよびタンパク質発現が検証され、ウイルスベクター20を用いた別のアプローチで確認された。数年後、MG特異的 Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl レポーターマウス24を用いて、これらの培養物に見られる細胞の大部分がMGであることを確認した。さらに、FACS精製MGおよび培養初代MGの両方におけるmiRNAのセットの定量は、MG miRNA(mGLiomiRs)のレベルが増殖期中の培養MGにおいてあまり変化しないことを示した。しかし、培養期間が細長いと、miRNAが翻訳調節因子であるため、miRNAレベル、ひいてはmRNAレベルおよびタンパク質発現の変化を引き起こす25。
2013年、このMG培養モデルを用いて、MGを網膜ニューロンに再プログラムする能力に関して様々な転写因子を試験した20。Ascl1は非常に堅牢で信頼性の高いリプログラミング因子であることが判明しました。ウイルスベクターを介したAscl1の過剰発現は、形態学的変化、ニューロンマーカーの発現、およびニューロン電気生理学的特性の獲得を誘導した。さらに重要なことに、これらの最初のインビトロ実験から得られた洞察と結果は、インビボアプリケーション22,26に首尾よく転送され、初代MG培養物がインビボ実装前の初期因子スクリーニングおよびグリア特徴の評価のための固体で信頼性の高いツールを表すことを実証した。
数年前、網膜ニューロンでも高発現している脳富化miRNA miR-124が、培養MG21でAscl1発現を誘導できることが示されました。生細胞におけるAscl1発現を、Ascl1レポーターマウス(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)を介して可視化した。レポーターマウスは、DNAにレポーター遺伝子が挿入された遺伝子操作マウスです。このレポーター遺伝子は、本研究における赤色蛍光タンパク質であるtdTomatoであるレポータータンパク質をコードする。このレポータータンパク質は、目的の遺伝子(この場合はAscl1)の発現を報告する。つまり、Ascl1 を発現する細胞は赤色に変わります。Ascl1はRPCs9でのみ発現するため、このAscl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/flマウスは、RPCを発現するAscl1へのMG変換の追跡を可能にし、変換細胞が赤色蛍光tdTomatoレポータータンパク質を発現することを意味する。これらの細胞のDNAが改変されるため、これは不可逆的な標識である。その結果、tdTomato標識が分化細胞に残るため、その後の神経分化は視覚化されます。MG由来RPC(tdTomato標識を有する)を発現するAscl1がニューロンに分化したとしても、これらのニューロンは依然として赤色のラベルを有する。したがって、このマウスは、生細胞イメージングのためのMG由来RPCの標識を可能にするだけでなく、これらのMG由来(赤色)RPCの運命マッピングおよび系統追跡も可能にする。より最近では、RPC中のmiRNAのセットが同定され、Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPCレポーターマウスのMG培養物を用いて、これらのmiRNAがリプログラミング能力および効率に及ぼす影響をスクリーニングおよび試験した27。候補の1つであるRPC-miRNA miR-25は、培養したMGをAscl1発現細胞(Ascl1-Tomato+)にリプログラミングできることを見出した。これらの再プログラムされた細胞は、ニューロンの形態(小さなソマタおよび短いまたは長い微細プロセスのいずれか)、scRNA-Seqを介して測定されたニューロン転写産物の発現、ならびに免疫蛍光標識を介して検証されたニューロンタンパク質の発現を含む、経時的なニューロンの特徴を採用する27。
ここで、プロトコルは、以前の研究21、24、27から適応したP12マウスからMGを増殖およびトランスフェクトする方法を詳述する。このプロトコールのために選択されたのは、前述のmiRNA miR-25であり、RPCにおいて高発現し、MGまたは網膜ニューロンにおいて低い発現レベルを有するmiRNAである。miR−25を過剰発現させるために、マウスmiR−25模倣体、すなわち、人工miRNA分子が使用される。対照として、Caenorhabditis elegansからのmiRNAの模倣物が選択され、哺乳動物細胞では機能を持たない。MGのRPCへの変換の可視化は、RPCレポーターマウス(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)、バックグラウンドが混在するマウス(C57BL/6、S129、およびICR株)を介して達成された。しかしながら、この培養は、野生型株を含むすべてのマウス株を用いて行うことができる。過去数年間で、元のプロトコルは、成長期の持続時間と全体的な培養期間を短縮し、より堅牢なグリア細胞の状態を確保し、長期の培養期間に起こる細胞変性の程度を最小限に抑えるように変更されました。通常のトランスフェクション時間枠も3時間から2日に延長されました。前述のように、現在のプロトコルはMG培養物を再生研究のためのツールとして記述しているが、この方法は初期化因子の試験に有用であるだけでなく、MG遊走性または増殖性挙動、傷害/細胞損傷関連のパラダイム、および/または根底にあるメカニズムおよび経路の同定に関する研究を含む他の用途にも適応させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、miRNAを用いたリプログラミング研究のために、解離したマウス網膜からMGを増殖させる方法を記載している。様々な先行研究で示され、確認されたように、これらの培養物中に見出された細胞の大多数(80%〜90%)はMG20、23、24である。この方法は非常に堅牢で信頼性の高い技術であり、プロトコルが正しく?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Ann Beaton博士とすべての研究室メンバーに原稿へのインプットに感謝します。シアトルのワシントン大学でのポスドク研修中に、MG初代文化をスクリーニングツールとしてS.G.W.に紹介してくれたTom Reh博士、Julia Pollak博士、Russ Taylor博士に特に感謝します。この研究は、S.G.W.へのEmpire Innovation Program(EIP)グラントとSUNY検眼からS.G.W.へのスタートアップ資金、およびNational Eye Institute(NEI)からS.G.W.へのR01EY032532賞によって資金提供されました。
Materials
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
Referências
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