Müller glia primära kulturer erhållna från mus näthinnor representerar ett mycket robust och pålitligt verktyg för att studera glialomvandlingen till retinala stamceller efter mikroRNA-behandling. Enstaka molekyler eller kombinationer kan testas innan de senare tillämpas in vivo-metoder .
Müller glia (MG) är den dominerande glia i neurala näthinnan och kan fungera som en regenerativ källa för retinala nervceller. Hos lägre ryggradsdjur som fisk sker MG-driven regenerering naturligt; hos däggdjur krävs dock stimulering med vissa faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulation. Eftersom MG endast utgör 5% av retinalcellpopulationen finns det ett behov av modellsystem som tillåter studier av denna cellpopulation uteslutande. Ett av dessa modellsystem är primära MG-kulturer som är reproducerbara och kan användas för en mängd olika applikationer, inklusive molekyl/ faktorscreening och identifiering, testning av föreningar eller faktorer, cellövervakning och / eller funktionella tester. Denna modell används för att studera potentialen hos murin MG att omvandlas till retinala nervceller efter tillskott eller hämning av mikroRNA (miRNA) via transfektion av artificiella miRNA eller deras hämmare. Användningen av MG-specifika reportermöss i kombination med immunofluorescerande märkning och encells RNA-sekvensering (scRNA-seq) bekräftade att 80%-90% av cellerna som finns i dessa kulturer är MG. Med hjälp av denna modell upptäcktes att miRNA kan omprogrammera MG till retinala stamceller (RPC), som därefter differentieras till neuronalliknande celler. Fördelarna med denna teknik är att miRNA-kandidater kan testas för deras effektivitet och resultat innan de används i in vivo-applikationer .
Müller glia (MG) är den dominerande glia i neural näthinnan. De har liknande funktioner jämfört med andra glia i andra delar av centrala nervsystemet, såsom att upprätthålla vatten- och jonhomeostas, närande neuroner och skydda vävnaden. MG har en annan fascinerande egenskap: även om de är mogna glia, uttrycker de fortfarande många gener uttryckta i retinala stamceller (RPC) under sen utveckling 1,2. Denna likhet antas vara orsaken till den naturligt förekommande MG-baserade neuronala regenereringen i fiskhinnan efter näthinneskada 3,4. Under denna process, MG återinträda i cellcykeln och de-differentiera till RPC som sedan differentierar till alla sex typer av retinala nervceller. Även om detta fenomen förekommer naturligt hos fisk, omvandlas däggdjurs MG inte till nervceller 5,6. De kan dock omprogrammeras. En mängd olika faktorer har visat sig omprogrammera MG till RPC/ nervceller; bland dessa faktorer är den grundläggande helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktorn achaete-scute homolog 1 (Ascl1) som är involverad i fiskregenerering 7,8. Hos möss uttrycks Ascl1 endast i RPC under retinogenes men saknas i mogna MG- eller retinalneuroner9.
Omprogrammering av celler direkt in vivo är inte bara metodologiskt utmanande utan kräver också godkännande från en institutionell djurvårds- och användningskommitté. För att få godkännande krävs preliminära uppgifter om den eller de faktorer som används eller ändras, koncentrationer, effekter utanför målet, underliggande mekanismer, toxicitet och effektivitet. Cellodlingssystem möjliggör testning för dessa kriterier före användning i in vivo-modeller. Eftersom MG endast utgör cirka 5 % av hela näthinnecellpopulationen10, tillåter MG-kulturer dessutom studier av deras funktion11 samt deras beteende, inklusive migration12,13, proliferation14, stressreaktion på skada/skada15,16, deras interaktion med andra celltyper såsom microglia17 eller retinala ganglionceller (RGCs)18, eller deras neurogena potential 19,20,21. Många forskare använder odödliga cellinjer för sina studier eftersom de har en obegränsad proliferativ potential och lätt kan underhållas och transinfekteras. Primära celler är dock att föredra för biologiskt relevanta analyser än odödliga celler eftersom de har sanna cellegenskaper (gen- och proteinuttryck) och, ännu viktigare, de representerar ett visst utvecklingsstadium och har därför en “ålder”. Åldern hos ett djur (och följaktligen hos cellerna som erhållits från ett djur) är en särskilt avgörande faktor vid cellulär omprogrammering eftersom cell plasticitet minskar med framskridet utvecklingsstadium22.
Detta protokoll beskriver i detalj hur man omprogrammerar primär MG med miRNA som en aktuell in vitro-metod för att studera regenerering. Denna primära MG-odlingsmodell etablerades 2012 för att utvärdera cellproliferationsegenskaper hos MG hos P53 knock-out-möss (trp53-/- möss)23. Det visades att odlad MG behåller sina glialegenskaper (dvs uttryck av S100β-, Pax6- och Sox2-proteiner utvärderade via immunofluorescerande märkning) och att de liknar in vivo MG (mikroarray av FACS-renad MG)23. Kort därefter validerades och bekräftades glial mRNA och proteinuttryck i ett annat tillvägagångssätt med hjälp av virala vektorer20. Några år senare bekräftades att de allra flesta celler som finns i dessa kulturer är MG med hjälp av den MG-specifika Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reportermus24. Dessutom visade kvantifiering av uppsättningen miRNA i både FACS-renad MG och odlad primär MG att nivåerna av MG miRNA (mGLiomiRs) inte varierar mycket i odlad MG under tillväxtfasen. Långsträckta odlingsperioder orsakar emellertid förändringar i miRNA-nivåer och följaktligen i mRNA-nivåer och proteinuttryck eftersom miRNA är translationella regulatorer25.
I 2013, denna MG kulturmodell användes för att testa en mängd olika transkriptionsfaktorer med avseende på deras förmåga att omprogrammera MG till retinala nervceller20. Ascl1 befanns vara en mycket robust och pålitlig omprogrammeringsfaktor. Överuttryck av Ascl1 via virala vektorer inducerade morfologiska förändringar, uttryck av neuronala markörer och förvärv av neuronala elektrofysiologiska egenskaper. Ännu viktigare är att de insikter och resultat som erhölls från dessa första in vitro-experiment framgångsrikt överfördes till in vivo-applikationer 22,26, vilket visar att primära MG-kulturer representerar ett solidt och pålitligt verktyg för initiala faktorscreeningar och utvärdering av glialfunktioner före in vivo-implementering.
För några år sedan visade det sig att det hjärnberikade miRNA miR-124, som också uttrycks starkt i näthinneneuroner, kan inducera Ascl1-uttryck i odlad MG21. Ascl1-uttryck i levande celler visualiserades via pt Ascl1-reportermus (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). En reportermus är en genetiskt konstruerad mus som har en reportergen införd i sitt DNA. Denna reportergen kodar för ett reporterprotein, som i denna studie är tdTomato, ett rött fluorescerande protein. Detta reporterprotein rapporterar uttrycket av en gen av intresse, i detta fall Ascl1. Med andra ord blir celler som uttrycker Ascl1 röda. Eftersom Ascl1 endast uttrycks i RPC9 tillåter denna Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-mus spårning av MG-omvandling till Ascl1 som uttrycker RPC, vilket innebär att konverterande celler kommer att uttrycka rött fluorescerande tdTomato-reporterprotein. Detta är irreversibel märkning eftersom DNA från dessa celler förändras. Följaktligen kommer all efterföljande neuronal differentiering att visualiseras eftersom tdTomato-etiketten förblir i differentierande celler. Om Ascl1 som uttrycker MG-härledda RPC (med tdTomato-etikett) differentieras till neuroner, kommer dessa neuroner fortfarande att ha sin röda etikett. Denna mus tillåter därför inte bara märkning av MG-härledda RPC för levande cellavbildning utan möjliggör också ödeskartläggning och spårning av dessa MG-härledda (röda) RPC. På senare tid identifierades uppsättningen miRNA i RPC och MG-kulturer av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermöss användes för att screena och testa effekten av dessa miRNA på omprogrammeringskapacitet och effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, befanns kunna omprogrammera odlad MG till Ascl1-uttryckande (Ascl1-Tomat+) celler. Dessa omprogrammerade celler antar neuronala egenskaper över tid, inklusive neuronal morfologi (liten somata och antingen korta eller långa fina processer), uttryck av neuronala transkript mätt via scRNA-Seq, samt uttryck av neuronala proteiner validerade via immunofluorescerande märkning27.
Här beskriver protokollet hur man odlar och transfekterar MG från P12-möss anpassat från det tidigare arbetet 21,24,27. Valt för detta protokoll är ovannämnda miRNA miR-25, ett miRNA som uttrycks starkt i RPC, med låga uttrycksnivåer i MG- eller retinalneuroner. För att överuttrycka miR-25 härmar murin miR-25, dvs artificiella miRNA-molekyler används. Som kontroll väljs miRNA av ett miRNA från Caenorhabditis elegans, som inte har någon funktion i däggdjursceller. Visualisering av omvandlingen av MG till RPC utfördes via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandad bakgrund (C57BL / 6, S129 och ICR-stammar). Denna kultur kan dock utföras med alla musstammar, inklusive vildtypsstammar. Under de senaste åren har det ursprungliga protokollet modifierats för att minska tillväxtfasens varaktighet och den totala odlingsperioden och säkerställa en mer robust gliacellstatus och minimera graden av cellulär degenerering, som inträffar under långa odlingsperioder. Det vanliga transfektionstidsfönstret förlängdes också från 3 h till 2 dagar. Som nämnts tidigare, även om det nuvarande protokollet beskriver MG-kulturer som ett verktyg för regenereringsstudier, är metoden inte bara användbar för att testa omprogrammeringsfaktorer, utan kan också anpassas för andra applikationer, inklusive studier om MG-migrerande eller proliferativt beteende, skade- / cellskadarelaterade paradigmer och / eller identifiering av underliggande mekanismer och vägar.
Detta protokoll beskriver hur man odlar MG från dissocierade musnäthinnor för omprogrammering av studier med miRNA. Som visats och bekräftats i en mängd tidigare studier är de allra flesta (80% -90%) av cellerna som finns i dessa kulturer MG 20,23,24. Denna metod är en mycket robust och pålitlig teknik och resultaten kan enkelt reproduceras om protokollet följs korrekt21,27<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr. Ann Beaton och alla labbmedlemmar för deras input på manuskriptet. Särskilt tack till Drs. Tom Reh, Julia Pollak och Russ Taylor för att ha introducerat MG primära kulturer som ett screeningverktyg för SGS under postdoktoral utbildning vid University of Washington i Seattle. Studien finansierades av Empire Innovation Program (EIP) Grant till S.G.W. och startfonder från SUNY Optometry till S.G.W., samt R01EY032532-utmärkelsen från National Eye Institute (NEI) till S.G.W.
Animals | |||
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
Reagents | |||
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
plasticware/supplies | |||
0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
equipment | |||
1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |