カンジダ・アルビカンスにおける転写因子-DNA結合相互作用のゲノムワイドプロファイリング:包括的なCUT&RUN法とデータ解析ワークフロー
Summary
このプロトコルは、ヒト真菌病原体カン ジダ・アルビカンスにおけるヌクレアーゼ(CUT&RUN)を用いた標的下での切断および放出のための実験方法およびデータ分析ワークフローを記述する。
Abstract
調節転写因子は、細胞分化、環境摂動およびストレスに対する応答、宿主 – 病原体相互作用を含む多くの重要な生物学的プロセスを制御する。DNAへの調節転写因子のゲノムワイド結合を決定することは、これらのしばしば複雑な生物学的プロセスにおける転写因子の機能を理解するために不可欠である。ヌクレアーゼ(CUT&RUN)を用いた標的下での切断および放出は、 in vivo タンパク質-DNA結合相互作用のゲノムワイドマッピングのための現代的な方法であり、従来広く使用されているクロマチン免疫沈降法に続いてシーケンシング(ChIP-seq)法に代わる魅力的な代替法です。CUT&RUNは、高スループットの実験セットアップに適しており、ChIP-seqよりもサンプルあたりのシーケンシングコストが低く、ダイナミックレンジが大幅に高くなっています。ここでは、ヒト真菌病原体カン ジダ・アルビカン スにおける転写因子-DNA結合相互作用のゲノムワイド解析用に調整された包括的なCUT&RUNプロトコルおよび付随するデータ解析ワークフローについて説明する。この詳細なプロトコルには、転写因子コード遺伝子のエピトープタグ付けからシーケンシングのためのライブラリー調製まで、必要なすべての実験手順が含まれています。さらに、CUT&RUNデータ分析用にカスタマイズされた計算ワークフローが含まれています。
Introduction
カンジダ・アルビカンスは、臨床的に関連性のある多型ヒト真菌病原体であり、プランクトン(自由浮遊)成長様式およびバイオフィルム増殖様式として知られる細胞外マトリックスによって保護された強固に接着した細胞のコミュニティなど、様々な異なる成長様式に存在する1,2,3。他の発生および細胞プロセスと同様に、バイオフィルム発生は、配列特異的にDNAに結合する調節転写因子(TF)によって転写レベルで制御されることが知られている重要なC.アルビカンスの病原性形質である4。最近、クロマチン調節因子およびヒストン調節因子もまた、DNAアクセシビリティを媒介することによってC.アルビカンスバイオフィルム形成5および形態形成6の重要な調節因子として浮上している。この重要な真菌病原体の複雑な生物学を理解するためには、明確な発生過程および細胞過程における特定のTFのゲノムワイド局在を決定する効果的な方法が貴重である。
クロマチン免疫沈降とそれに続くシーケンシング(ChIP-seq)は、C. albicans 5,6におけるタンパク質-DNA相互作用を調べるために広く使用されている方法であり、マイクロアレイ(ChIP-chip)9法に続くより古典的なクロマチン免疫沈降法に大きく取って代わっています。しかしながら、ChIP-seq法およびChIPチップ法はいずれも、多数の入力細胞10を必要とし、これは、患者または感染の動物モデルから収集されたバイオフィルムなどの特定のサンプルおよび増殖様式の文脈においてTFを調査する際に複雑な要因となり得る。さらに、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイは、ゲノム全体にかなりの量のバックグラウンドシグナルを生じることが多く、目的の標的がシグナルをノイズから十分に分離するために高レベルの濃縮を必要とする。ChIPチップアッセイは今日では大部分が時代遅れですが、ChIP-seqに必要なシーケンシング深さにより、このアッセイは多くの研究者、特に複数のTFおよび/またはクロマチン関連タンパク質を研究する研究者にとって非常に高価です。
標的下での切断とヌクレアーゼ(CUT&RUN)を用いた放出は、ChIP-seqの魅力的な代替手段です。ChIP-seqとクロマチンの内因性切断の限界を回避し、TFとクロマチン関連タンパク質の高解像度のゲノムワイドマッピングを提供しながら、タンパク質-DNA相互作用をゲノムワイドレベルで同定する別の方法であるChEC-seq 11,12のシーケンシングを行うために、2017年にHenikoff研究所によって開発されました13.CUT&RUNは、連結ミクロコッカスヌクレアーゼを用いた透過処理核内のクロマチンの標的消化に依存し、続いて消化されたDNA断片の配列決定9,10である。DNA断片は、ChIPアッセイのようにランダムな断片化を介してゲノム全体に生成されるのではなく、目的のタンパク質によって結合された遺伝子座で特異的に生成されるため、CUT&RUNアプローチはバックグラウンドシグナルを大幅に低減し、したがって、ChIP-seq 11,13と比較してシーケンシング深さの1/10を必要とします。14。これらの改善は、最終的にシーケンシングコストの大幅な削減と、各サンプルの出発物質として必要な入力セルの総数の削減につながります。
ここでは、バイオフィルムおよびプランクトン培養物から単離された C.アルビカン ス細胞におけるTFのゲノムワイドな局在を決定するために適応および最適化された堅牢なCUT&RUNプロトコルが記載されている。また、結果として得られる配列データの処理と分析を可能にし、コーディングやバイオインフォマティクスに関する最小限の専門知識しか必要としない徹底的なデータ分析パイプラインも提示されます。簡単に言えば、このプロトコルは、TFコード遺伝子のエピトープタグ付け、バイオフィルムおよびプランクトン細胞の採取、無傷の透過処理された核の単離、特定のタンパク質または目的のエピトープタグ付きタンパク質に対する一次抗体とのインキュベーション、キメラA / Gミクロコッカスヌクレアーゼ(pAG-MNase)融合タンパク質の一次抗体へのテザリング、クロマチン消化後のゲノムDNA回収、およびシーケンシングのためのゲノムDNAライブラリーの調製を記述する。
実験的なCUT&RUNプロトコルに続いて、FASTQフォーマットで生のDNAシーケンシング読み取りを行い、必要なすべての処理ステップを実装して、目的のTF(一次抗体によって標的とされる)によって結合された著しく濃縮された遺伝子座の完全なリストを提供する専用のデータ解析パイプラインが続きます。記載されたライブラリ調製プロトコルの複数のステップは、(ヌクレオソームとは対照的に)TFのCUT&RUN分析に特別に適合および最適化されていることに注意してください。この原稿で提示されたデータは、市販のCUT&RUNキットのTF特異的適応を使用して生成されたものですが、これらのプロトコルは、個別に供給されたコンポーネント(すなわち、pAG-MNase酵素および磁気DNA精製ビーズ)および社内で調製されたバッファーを使用して検証されており、実験コストを大幅に削減することができます。包括的な実験およびデータ分析プロトコルは、ステップバイステップの形式で以下に詳細に説明されています。すべての試薬および重要な装置、ならびに緩衝液および培地レシピは、それぞれ 材料表 および 補足ファイル1にリストされています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、C. albicansにおける調節TFのゲノムワイド局在化のための包括的な実験的および計算的パイプラインを提示する。標準的な微生物学および分子生物学のトレーニングを受けている人なら誰でも非常にアクセスしやすいように設計されています。CUT&RUNアッセイの高ダイナミックレンジと低サンプルインプット要件を活用し、C. albicansバイオフィルムおよびプランク…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NobileとHerndayの研究室の過去と現在のすべてのメンバーに、原稿に関するフィードバックに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立一般医科学研究所(NIGMS)の賞番号R35GM124594と、C.J.N.に寄贈された椅子の形でカマンガル家によって支援されました。この研究は、NIH国立アレルギー感染症研究所(NIAID)の賞番号R15AI137975からADh..C.L.E.まで、NIH国立歯科頭蓋顔面研究所(NIDCR)フェローシップ番号F31DE028488によっても支援されました。コンテンツは著者の単独の責任であり、資金提供者の見解を表すものではありません。資金提供者は研究の設計において何の役割も持たなかった。データの収集、分析、または解釈において。原稿の執筆において。または結果を公開する決定で。
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
Referências
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
- Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
- Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
- Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
- Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
- Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
- Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
- Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).
