Genom-dækkende profilering af transkriptionsfaktor-DNA-bindende interaktioner i Candida albicans: En omfattende CUT &RUN-metode og dataanalysearbejdsgang
Summary
Denne protokol beskriver en eksperimentel metode og dataanalysearbejdsgang for spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT & RUN) i det humane svampepatogen Candida albicans.
Abstract
Regulatoriske transkriptionsfaktorer styrer mange vigtige biologiske processer, herunder cellulær differentiering, reaktioner på miljøforstyrrelser og belastninger og værtspatogeninteraktioner. Bestemmelse af den genom-brede binding af regulatoriske transkriptionsfaktorer til DNA er afgørende for at forstå funktionen af transkriptionsfaktorer i disse ofte komplekse biologiske processer. Spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT&RUN) er en moderne metode til genom-dækkende kortlægning af in vivo-protein-DNA-bindingsinteraktioner, der er et attraktivt alternativ til den traditionelle og udbredte kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventeringsmetode (ChIP-seq). CUT&RUN er modtagelig for en eksperimentel opsætning med højere gennemstrømning og har et væsentligt højere dynamisk område med lavere sekventeringsomkostninger pr. prøve end ChIP-seq. Her beskrives en omfattende CUT&RUN-protokol og tilhørende dataanalysearbejdsgang, der er skræddersyet til genom-dækkende analyse af transkriptionsfaktor-DNA-bindende interaktioner i det humane svampepatogen Candida albicans. Denne detaljerede protokol omfatter alle nødvendige eksperimentelle procedurer, fra epitopmærkning af transkriptionsfaktorkodende gener til biblioteksforberedelse til sekventering; Derudover inkluderer den en tilpasset beregningsarbejdsgang til CUT & RUN-dataanalyse.
Introduction
Candida albicans er et klinisk relevant, polymorft humant svampepatogen, der findes i en række forskellige vækstformer, såsom den planktoniske (fritflydende) vækstform og som samfund af tæt klæbende celler beskyttet af en ekstracellulær matrix, kendt som biofilmtilstanden for vækst 1,2,3. I lighed med andre udviklingsmæssige og cellulære processer er biofilmudvikling et vigtigt C. albicans virulenstræk, der vides at blive kontrolleret på transkriptionsniveau af regulatoriske transkriptionsfaktorer (TF’er), der binder til DNA på en sekvensspecifik måde4. For nylig har kromatinregulatorer og histonmodifikatorer også vist sig som vigtige regulatorer af C. albicans biofilmdannelse5 og morfogenese6 ved at formidle DNA-tilgængelighed. For at forstå den komplekse biologi af dette vigtige svampepatogen er effektive metoder til bestemmelse af genom-wide lokalisering af specifikke TF’er under forskellige udviklingsmæssige og cellulære processer værdifulde.
Kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventering (ChIP-seq) er en meget anvendt metode til at undersøge protein-DNA-interaktioner i C. albicans 5,6 og har stort set erstattet den mere klassiske kromatinimmunfældning efterfulgt af mikroarray (ChIP-chip)9-metoden. Både ChIP-seq- og ChIP-chip-metoder kræver imidlertid et stort antal inputceller10, hvilket kan være en komplicerende faktor, når man undersøger TF’er i forbindelse med specifikke prøver og vækstformer, såsom biofilm indsamlet fra patienter eller dyremodeller for infektion. Derudover giver kromatinimmunfældningsassayet (ChIP) ofte en betydelig mængde baggrundssignal i hele genomet, hvilket kræver et højt berigelsesniveau for målet af interesse for at adskille signal tilstrækkeligt fra støj. Mens ChIP-chip-analysen stort set er forældet i dag, gør de sekventeringsdybder, der er nødvendige for ChIP-seq, dette assay uoverkommeligt dyrt for mange forskere, især dem, der studerer flere TF’er og / eller kromatin-associerede proteiner.
Spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT&RUN) er et attraktivt alternativ til ChIP-seq. Det blev udviklet af Henikoff-laboratoriet i 2017 for at omgå begrænsningerne ved ChIP-seq og kromatin endogen spaltning efterfulgt af sekventering af ChEC-seq11,12, en anden metode til at identificere protein-DNA-interaktioner på et genom-bredt niveau, samtidig med at der tilvejebringes højopløselig, genom-dækkende kortlægning af TF’er og kromatin-associerede proteiner13 . CUT&RUN er afhængig af den målrettede fordøjelse af kromatin i permeabiliserede kerner ved hjælp af tekerede mikrokoknukleaser efterfulgt af sekventering af de fordøjede DNA-fragmenter 9,10. Da DNA-fragmenter specifikt genereres på loci, der er bundet af et protein af interesse, snarere end at blive genereret i hele genomet via tilfældig fragmentering som i ChIP-assays, resulterer CUT&RUN-tilgangen i stærkt reducerede baggrundssignaler og kræver således 1/10th af sekventeringsdybden sammenlignet med ChIP-seq11,13, 14. Disse forbedringer fører i sidste ende til betydelige reduktioner i sekventeringsomkostningerne og reduktioner i det samlede antal inputceller, der er nødvendige som udgangsmateriale for hver prøve.
Her beskrives en robust CUT&RUN-protokol, der er blevet tilpasset og optimeret til bestemmelse af genom-wide lokalisering af TF’er i C. albicans celler isoleret fra biofilm og planktoniske kulturer. Der præsenteres også en grundig dataanalysepipeline, som muliggør behandling og analyse af de resulterende sekvensdata og kræver, at brugerne har minimal ekspertise inden for kodning eller bioinformatik. Kort fortalt beskriver denne protokol epitopmærkning af TF-kodende gener, høst af biofilm og planktoniske celler, isolering af intakte permeabiliserede kerner, inkubation med primære antistoffer mod det specifikke protein eller epitopmærkede protein af interesse, tethering af de kimære A / G-mikrokoknuklease (pAG-MNase) fusionsproteiner til de primære antistoffer, genomisk DNA-genopretning efter kromatinfordøjelse og forberedelse af genomiske DNA-biblioteker til sekventering.
Den eksperimentelle CUT&RUN-protokol efterfølges af en specialbygget dataanalysepipeline, der tager rå DNA-sekventeringslæsninger i FASTQ-format og implementerer alle nødvendige behandlingstrin for at give en komplet liste over signifikant berigede loci bundet af TF af interesse (målrettet mod det primære antistof). Bemærk, at flere trin i den beskrevne biblioteksforberedelsesprotokol er specielt tilpasset og optimeret til CUT&RUN-analyse af TF’er (i modsætning til nukleosomer). Mens de data, der præsenteres i dette manuskript, blev genereret ved hjælp af TF-specifikke tilpasninger af et kommercielt CUT&RUN-sæt, er disse protokoller også blevet valideret ved hjælp af individuelt fremskaffede komponenter (dvs. pAG-MNase-enzym og magnetiske DNA-oprensningsperler) og internt forberedte buffere, hvilket kan reducere eksperimentelle omkostninger betydeligt. De omfattende eksperimentelle og dataanalyseprotokoller er beskrevet detaljeret nedenfor i et trin-for-trin format. Alle reagenser og kritisk udstyr samt buffer- og medieopskrifter er opført i henholdsvis materialetabellen og supplerende fil 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol præsenterer en omfattende eksperimentel og beregningsmæssig pipeline til genom-wide lokalisering af regulatoriske TF’er i C. albicans. Det er designet til at være meget tilgængeligt for alle med standard mikrobiologi og molekylærbiologi uddannelse. Ved at udnytte det høje dynamiske område og de lave prøveinputkrav i CUT&RUN-analysen og inkludere optimeringer til lokalisering af TF-DNA-bindingsinteraktioner i C. albicans biofilm og planktoniske kulturer præsenterer denne protokol …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle tidligere og nuværende medlemmer af Nobile og Hernday laboratorierne for feedback på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) tildelingsnummer R35GM124594 og af Kamangar-familien i form af en begavet stol til C.J.N. Dette arbejde blev også støttet af NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) tildelingsnummer R15AI137975 til A.D.H.C.L.E. blev støttet af NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) stipendienummer F31DE028488. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke bidragydernes synspunkter. Finansiererne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen; i indsamling, analyse eller fortolkning af data i skrivningen af manuskriptet eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
Referências
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
- Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
- Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
- Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
- Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
- Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
- Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
- Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).
