Genomomfattende profilering av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i Candida albicans: En omfattende CUT&RUN-metode og arbeidsflyt for dataanalyse
Summary
Denne protokollen beskriver en eksperimentell metode- og dataanalysearbeidsflyt for spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease (CUT&RUN) i det menneskelige sopppatogenet Candida albicans.
Abstract
Regulatoriske transkripsjonsfaktorer kontrollerer mange viktige biologiske prosesser, inkludert cellulær differensiering, respons på miljøperturbasjoner og spenninger, og vertspatogeninteraksjoner. Å bestemme den genomomfattende bindingen av regulatoriske transkripsjonsfaktorer til DNA er avgjørende for å forstå funksjonen til transkripsjonsfaktorer i disse ofte komplekse biologiske prosessene. Cleavage under mål og frigjøring ved hjelp av nuklease (CUT&RUN) er en moderne metode for genom-wide kartlegging av in vivo protein-DNA bindende interaksjoner som er et attraktivt alternativ til den tradisjonelle og mye brukte kromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) metode. CUT&RUN er egnet til et eksperimentelt oppsett med høyere gjennomstrømning og har et betydelig høyere dynamisk område med lavere sekvenseringskostnader per prøve enn ChIP-seq. Her beskrives en omfattende CUT&RUN-protokoll og tilhørende dataanalysearbeidsflyt skreddersydd for genomomfattende analyse av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i det menneskelige sopppatogenet Candida albicans . Denne detaljerte protokollen inkluderer alle nødvendige eksperimentelle prosedyrer, fra epitopmerking av transkripsjonsfaktorkodingsgener til bibliotekforberedelse for sekvensering; I tillegg inkluderer den en tilpasset beregningsarbeidsflyt for CUT&RUN-dataanalyse.
Introduction
Candida albicans er et klinisk relevant, polymorfisk menneskelig sopppatogen som eksisterer i en rekke forskjellige vekstformer, for eksempel den planktoniske (frittflytende) vekstmåten og som samfunn av tettsittende celler beskyttet av en ekstracellulær matrise, kjent som biofilmmodusen for vekst 1,2,3. I likhet med andre utviklings- og cellulære prosesser er biofilmutvikling et viktig C. albicans virulenstrekk som er kjent for å bli kontrollert på transkripsjonsnivå av regulatoriske transkripsjonsfaktorer (TFer) som binder seg til DNA på en sekvensspesifikk måte4. Nylig har kromatinregulatorer og histonemodifikatorer også dukket opp som viktige regulatorer for C. albicans biofilmformasjon5 og morfogenese6 ved å formidle DNA-tilgjengelighet. For å forstå den komplekse biologien til dette viktige sopppatogenet, er effektive metoder for å bestemme den genomomfattende lokaliseringen av spesifikke TFer under distinkte utviklings- og cellulære prosesser verdifull.
Kromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) er en mye brukt metode for å undersøke protein-DNA interaksjoner i C. albicans 5,6 og har i stor grad erstattet den mer klassiske kromatin immunoprecipitation etterfulgt av mikroarray (ChIP-chip)9 metode. Både ChIP-seq- og ChIP-chip-metoder krever imidlertid et stort antall inngangsceller10, noe som kan være en kompliserende faktor når du undersøker TFer i sammenheng med spesifikke prøver og vekstmåter, for eksempel biofilmer samlet inn fra pasienter eller dyremodeller av infeksjon. I tillegg gir kromatinimmunoprecipitation (ChIP) analysen ofte et betydelig mengde bakgrunnssignal gjennom hele genomet, noe som krever et høyt nivå av berikelse for målet om interesse for å tilstrekkelig skille signal fra støy. Selv om ChIP-chip-analysen i stor grad er utdatert i dag, gjør sekvenseringsdybdene som er nødvendige for ChIP-seq denne analysen uoverkommelig dyrt for mange forskere, spesielt de som studerer flere TFer og / eller kromatinrelaterte proteiner.
Cleavage under mål og frigjøring ved hjelp av nuclease (CUT&RUN) er et attraktivt alternativ til ChIP-seq. Det ble utviklet av Henikoff lab i 2017 for å omgå begrensningene i ChIP-seq og kromatin endogen spalting etterfulgt av sekvensering ChEC-seq11,12, en annen metode for å identifisere protein-DNA interaksjoner på et genom-bredt nivå, samtidig som det gir høyoppløselig, genom-bred kartlegging av TFs og kromatin-assosierte proteiner13 . CUT&RUN er avhengig av målrettet fordøyelse av kromatin i permeabiliserte kjerner ved hjelp av tethered mikrokokkkjerner, etterfulgt av sekvensering av de fordøyde DNA-fragmentene 9,10. Ettersom DNA-fragmenter genereres spesifikt på loci som er bundet av et protein av interesse, i stedet for å bli generert over hele genomet via tilfeldig fragmentering som i ChIP-analyser, resulterer CUT&RUN-tilnærmingen i sterkt reduserte bakgrunnssignaler og krever dermed 1/10th av sekvenseringsdybden sammenlignet med ChIP-seq11,13, 14. Disse forbedringene fører til slutt til betydelige reduksjoner i sekvenseringskostnader og reduksjoner i det totale antallet inngangsceller som trengs som startmateriale for hvert utvalg.
Her beskrives en robust CUT&RUN-protokoll som er tilpasset og optimalisert for å bestemme den genomomfattende lokaliseringen av TFer i C. albicansceller isolert fra biofilmer og planktoniske kulturer. Det presenteres også en grundig dataanalysepipeline som muliggjør behandling og analyse av de resulterende sekvensdataene og krever at brukerne har minimal kompetanse innen koding eller bioinformatikk. Kort fortalt beskriver denne protokollen epitopmerking av TF-kodingsgener, høsting av biofilm og planktoniske celler, isolering av intakt permeabilisert kjerne, inkubasjon med primære antistoffer mot det spesifikke protein- eller epitopmerkede proteinet av interesse, tethering av den chimeriske A / G-mikrokokkkjernen (pAG-MNase) fusjonsproteiner til de primære antistoffene, genomisk DNA-utvinning etter kromatin fordøyelse og fremstilling av genomiske DNA-biblioteker for sekvensering.
Den eksperimentelle CUT&RUN-protokollen etterfølges av en spesialbygd dataanalysepipeline, som tar rå DNA-sekvenseringslesninger i FASTQ-format og implementerer alle nødvendige behandlingstrinn for å gi en komplett liste over betydelig beriket loci bundet av TF av interesse (målrettet av det primære antistoffet). Vær oppmerksom på at flere trinn i den beskrevne bibliotekforberedelsesprotokollen er spesielt tilpasset og optimalisert for CUT&RUN-analyse av TFer (i motsetning til nukleosomer). Mens dataene som presenteres i dette manuskriptet ble generert ved hjelp av TF-spesifikke tilpasninger av et kommersielt CUT&RUN-sett, har disse protokollene også blitt validert ved hjelp av individuelt produserte komponenter (dvs. pAG-MNase-enzym og magnetiske DNA-renseperler) og interne forberedte buffere, noe som kan redusere eksperimentelle kostnader betydelig. De omfattende eksperimentelle protokollene og dataanalyseprotokollene er beskrevet i detalj nedenfor i et trinnvis format. Alle reagenser og kritisk utstyr, samt buffer- og medieoppskrifter, er oppført i henholdsvis materialtabellen og tilleggsfil 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen presenterer en omfattende eksperimentell og beregningsrørledning for genom-bred lokalisering av regulatoriske TFer i C. albicans. Den er designet for å være svært tilgjengelig for alle med standard mikrobiologi og molekylærbiologiopplæring. Ved å utnytte de høye dynamiske og lave kravene til prøveinngang i CUT&RUN-analysen og inkludert optimaliseringer for lokalisering av TF-DNA-bindingsinteraksjoner i C. albicans biofilm og planktoniske kulturer, presenterer denne protokollen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle tidligere og nåværende medlemmer av Nobile- og Hernday-laboratoriene for tilbakemeldinger på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) tildelingsnummer R35GM124594 og av Kamangar-familien i form av en begavet stol til C.J.N. Dette arbeidet ble også støttet av NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) tildelingsnummer R15AI137975 til A.D.H.C.L.E. ble støttet av NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) stipendiatnummer F31DE028488. Innholdet er forfatternes eget ansvar og representerer ikke fundernes synspunkter. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet; eller i beslutningen om å publisere resultatene.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
Referências
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
- Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
- Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
- Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
- Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
- Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
- Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
- Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).
