Bu protokol, insan mantar patojeni Candida albicans’ta nükleaz (CUT&RUN) kullanarak hedefler altında bölünme ve salınım için deneysel bir yöntem ve veri analizi iş akışını açıklamaktadır.
Düzenleyici transkripsiyon faktörleri, hücresel farklılaşma, çevresel pertürbasyonlara ve streslere verilen tepkiler ve konakçı-patojen etkileşimleri dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik süreci kontrol eder. Düzenleyici transkripsiyon faktörlerinin DNA’ya genom çapında bağlanmasının belirlenmesi, bu genellikle karmaşık biyolojik süreçlerde transkripsiyon faktörlerinin işlevini anlamak için esastır. Hedefler altında bölünme ve nükleaz (CUT&RUN) kullanılarak salınım, geleneksel ve yaygın olarak kullanılan kromatin immünopresipitasyonuna ve ardından dizileme (ChIP-seq) yöntemine çekici bir alternatif olan in vivo protein-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında haritalanması için modern bir yöntemdir. CUT&RUN, daha yüksek verimli bir deneysel kuruluma uygundur ve ChIP-seq’ten daha düşük numune başına sıralama maliyetleri ile önemli ölçüde daha yüksek bir dinamik aralığa sahiptir. Burada, insan mantar patojeni Candida albicans’taki transkripsiyon faktörü-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında analizi için uyarlanmış kapsamlı bir CUT&RUN protokolü ve beraberindeki veri analizi iş akışı açıklanmaktadır. Bu ayrıntılı protokol, transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin epitop etiketlemesinden, dizileme için kütüphane hazırlığına kadar gerekli tüm deneysel prosedürleri içerir; Ayrıca, CUT&RUN veri analizi için özelleştirilmiş bir hesaplama iş akışı içerir.
Candida albicans, planktonik (serbest yüzen) büyüme modu ve biyofilm büyüme modu 1,2,3 olarak bilinen hücre dışı bir matris tarafından korunan sıkıca yapışmış hücrelerin toplulukları gibi çeşitlifarklı büyüme modlarında bulunan klinik olarak alakalı, polimorfik bir insan mantar patojenidir. Diğer gelişimsel ve hücresel süreçlere benzer şekilde, biyofilm gelişimi, DNA’ya diziye özgü bir şekilde bağlanan düzenleyici transkripsiyon faktörleri (TF’ler) tarafından transkripsiyonel düzeyde kontrol edildiği bilinen önemli bir C. albicans virülans özelliğidir4. Son zamanlarda, kromatin düzenleyicileri ve histon değiştiriciler, DNA erişilebilirliğine aracılık ederek C. albicans biyofilm oluşumu5 ve morfogenez6’nın önemli düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır. Bu önemli mantar patojeninin karmaşık biyolojisini anlamak için, farklı gelişimsel ve hücresel süreçler sırasında spesifik TF’lerin genom çapında lokalizasyonunu belirlemek için etkili yöntemler değerlidir.
Kromatin immünopresipitasyonu ve ardından dizileme (ChIP-seq), C. albicans 5,6’da protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve büyük ölçüde daha klasik kromatin immünopresipitasyonunun yerini mikroarray (ChIP-çip)9 yönteminin almıştır. Bununla birlikte, hem ChIP-seq hem de ChIP-çip yöntemleri, hastalardan toplanan biyofilmler veya hayvan enfeksiyon modelleri gibi belirli örnekler ve büyüme modları bağlamında TF’leri araştırırken karmaşık bir faktör olabilecek çok sayıda giriş hücresi10 gerektirir. Ek olarak, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi genellikle genom boyunca önemli miktarda arka plan sinyali verir ve ilgilenilen hedefin sinyali gürültüden yeterince ayırması için yüksek düzeyde zenginleştirme gerektirir. ChIP-çip testi bugün büyük ölçüde modası geçmiş olsa da, ChIP-seq için gerekli sıralama derinlikleri, bu tahlili birçok araştırmacı için, özellikle de birden fazla TF ve / veya kromatin ile ilişkili proteinleri inceleyenler için yasaklayıcı bir şekilde pahalı hale getirmektedir.
Hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT&RUN) kullanarak serbest bırakma, ChIP-seq’e cazip bir alternatiftir. 2017 yılında Henikoff laboratuvarı tarafından ChIP-seq ve kromatin endojen bölünmesinin sınırlamalarını aşmak için geliştirildi ve ardından protein-DNA etkileşimlerini genom çapında bir düzeyde tanımlamak için başka bir yöntem olan ChEC-seq 11,12’yi diziledi, aynı zamanda TF’lerin ve kromatinle ilişkili proteinlerin yüksek çözünürlüklü, genom çapında haritalanmasını sağladı13 . CUT&RUN, bağlı mikrokokal nükleazlar kullanılarak geçirgenleştirilmiş çekirdekler içindeki kromatinin hedeflenen sindirimine ve ardından sindirilen DNA fragmanlarının dizilimine dayanır 9,10. DNA fragmanları, ChIP tahlillerinde olduğu gibi rastgele parçalanma yoluyla genom boyunca üretilmek yerine, özellikle ilgili bir protein tarafından bağlanan lokuslarda üretildiğinden, CUT&RUN yaklaşımı büyük ölçüde azaltılmış arka plan sinyalleri ile sonuçlanır ve bu nedenle, ChIP-seq 11,13’e kıyasla dizileme derinliğinin 1 / 10’unu gerektirir. 14. Bu iyileştirmeler nihayetinde sıralama maliyetlerinde önemli azalmalara ve her numune için başlangıç malzemesi olarak ihtiyaç duyulan toplam giriş hücresi sayısında azalmaya yol açmaktadır.
Burada, biyofilmlerden ve planktonik kültürlerden izole edilen C. albicans hücrelerinde TF’lerin genom çapında lokalizasyonunu belirlemek için uyarlanmış ve optimize edilmiş sağlam bir CUT&RUN protokolü tanımlanmıştır. Elde edilen dizi verilerinin işlenmesini ve analizini sağlayan ve kullanıcıların kodlama veya biyoinformatik konusunda minimum uzmanlığa sahip olmalarını gerektiren kapsamlı bir veri analizi boru hattı da sunulmaktadır. Kısaca, bu protokol TF kodlayan genlerin epitop etiketlemesini, biyofilm ve planktonik hücrelerin toplanmasını, bozulmamış geçirgen çekirdeklerin izolasyonunu, spesifik protein veya epitop etiketli ilgili proteine karşı birincil antikorlarla inkübasyonu, kimerik A / G-mikrokokal nükleaz (pAG-MNaz) füzyon proteinlerinin birincil antikorlara bağlanmasını, kromatin sindiriminden sonra genomik DNA geri kazanımını ve dizileme için genomik DNA kütüphanelerinin hazırlanmasını açıklamaktadır.
Deneysel CUT&RUN protokolünü, ham DNA dizileme okumalarını FASTQ formatında alan ve ilgilenilen TF (birincil antikor tarafından hedeflenen) tarafından bağlanan önemli ölçüde zenginleştirilmiş lokusların tam bir listesini sağlamak için gerekli tüm işleme adımlarını uygulayan, amaca yönelik bir veri analizi boru hattı izler. Açıklanan kütüphane hazırlama protokolünün birden fazla adımının, TF’lerin CUT&RUN analizi için özel olarak uyarlandığını ve optimize edildiğini unutmayın (nükleozomların aksine). Bu makalede sunulan veriler, ticari bir CUT&RUN kitinin TF’ye özgü uyarlamaları kullanılarak üretilirken, bu protokoller ayrıca bireysel kaynaklı bileşenler (yani, pAG-MNaz enzimi ve manyetik DNA saflaştırma boncukları) ve deneysel maliyeti önemli ölçüde azaltabilen şirket içi hazırlanmış tamponlar kullanılarak doğrulanmıştır. Kapsamlı deneysel ve veri analizi protokolleri aşağıda adım adım formatta ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Tüm reaktifler ve kritik ekipmanların yanı sıra tampon ve ortam tarifleri sırasıyla Malzeme Tablosu ve Ek Dosya 1’de listelenmiştir.
Bu protokol, C. albicans’taki düzenleyici TF’lerin genom çapında lokalizasyonu için kapsamlı bir deneysel ve hesaplamalı boru hattı sunmaktadır. Standart mikrobiyoloji ve moleküler biyoloji eğitimi alan herkes için oldukça erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır. CUT&RUN testinin yüksek dinamik aralığından ve düşük numune girdisi gereksinimlerinden yararlanarak ve C. albicans biyofilm ve planktonik kültürlerde TF-DNA bağlanma etkileşimlerinin lokalizasyonu için optimizasy…
The authors have nothing to disclose.
Nobile ve Hernday laboratuvarlarının geçmiş ve şimdiki tüm üyelerine makale hakkındaki geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) ödül numarası R35GM124594 ve Kamangar ailesi tarafından C.J.N.’ye bağışlanmış bir sandalye şeklinde desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda NIH Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) ödül numarası R15AI137975 tarafından A.D.H.’ye .C.L.E. tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve fon sağlayıcıların görüşlerini temsil etmemektedir. Fon verenlerin çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında; yazının yazımında; veya sonuçları yayınlama kararında.
0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
Agar | Criterion | C5001 | |
Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
Fluorescence microscope | User-dependent | ||
Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
High-speed centrifuge | User-dependent | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
Lens paper | VWR | 52846-001 | |
Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
NaCl | VWR | 470302-522 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
Thermocycler | User-dependent | ||
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
Yeast extract | Criterion | C7341 | |
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |