Organoïden van menselijke tand vestigen als een krachtig hulpmiddel voor mechanistisch onderzoek en regeneratieve therapie
Summary
We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.
Abstract
Tanden zijn van cruciaal belang in het leven, niet alleen voor voedselmasticatie en spraak, maar ook voor psychologisch welzijn. Kennis over de ontwikkeling en biologie van menselijke tanden is schaars. In het bijzonder is er niet veel bekend over de epitheelstamcellen van de tand en hun functie. We zijn erin geslaagd om een nieuw organoïde model te ontwikkelen dat vertrekt van menselijk tandweefsel (d.w.z. tandheelkundige follikel, geïsoleerd uit geëxtraheerde verstandskiezen). De organoïden zijn robuust en langdurig uitbreidbaar en recapituleren het voorgestelde menselijke tandepitheelstamcelcompartiment in termen van markerexpressie en functionele activiteit. In het bijzonder zijn de organoïden in staat om een ameloblastdifferentiatieproces te ontvouwen zoals dat in vivo optreedt tijdens amelogenese. Dit unieke organoïde model biedt een krachtig hulpmiddel om niet alleen de ontwikkeling van menselijke tanden te bestuderen, maar ook tandheelkundige pathologie, en kan de weg vrijmaken voor tandregeneratieve therapie. Het vervangen van verloren tanden door een biologische tand op basis van dit nieuwe organoïde model zou een aantrekkelijk alternatief kunnen zijn voor de huidige standaard implantatie van synthetische materialen.
Introduction
Tanden hebben een essentiële rol bij voedselmasticatie, spraak en psychologisch welzijn (zelfbeeld). De menselijke tand bestaat uit sterk gemineraliseerde weefsels met verschillende dichtheid en hardheid1. Tandglazuur, het hoofdbestanddeel van de tandkroon, is het hoogste gemineraliseerde weefsel in het menselijk lichaam. Tijdens de vorming van glazuur (amelogenese), wanneer tanden zich ontwikkelen, differentiëren tandheelkundige epitheelstamcellen (DESC’s) in glazuurvormende cellen (ameloblasten). Eenmaal gevormd, wordt het glazuur zelden gerepareerd of vernieuwd vanwege het apoptotische verlies van de ameloblasten bij het begin van tanduitbarsting1. Herstel van beschadigd glazuurweefsel, zoals veroorzaakt door trauma of bacteriële ziekte, wordt momenteel bereikt met behulp van synthetische materialen; deze hebben echter te kampen met belangrijke tekortkomingen zoals microlekage, inferieure osseo-integratie en verankering, eindige levensduur en gebrek aan volledig functionele reparatie2. Vandaar dat een robuuste en betrouwbare kweek van menselijke DESC’s met de capaciteit om ameloblasten te genereren en het potentieel om gemineraliseerd weefsel te produceren een belangrijke stap voorwaarts zou zijn op het gebied van tandheelkundige regeneratieve aard.
Kennis over humaan DESC-fenotype en biologische functie is schaars 3,4,5. Interessant is dat DESC’s van menselijke tanden zijn voorgesteld om te bestaan in de epitheelcelresten van Malassez (ERM), celclusters aanwezig in de tandheelkundige follikel (DF), die niet-gescheurde tanden omringt, en aanwezig blijft in het parodontale ligament rond de wortel zodra de tand uitbarst1. ERM-cellen die samen met tandpulp zijn gekweekt, blijken te differentiëren tot ameloblastachtige cellen en glazuurachtig weefsel te genereren6. Diepgaande studies naar de specifieke rol van ERM-cellen in glazuur (re-) generatie zijn echter beperkt vanwege het ontbreken van betrouwbare studiemodellen7. De huidige ERM in vitro kweeksystemen worden belemmerd door een beperkte levensduur en snel verlies van fenotype in de 2D-omstandigheden die standaard worden gebruikt 8,9,10,11,12. Daarom is een handelbaar in vitro systeem om menselijke DESC’s getrouw uit te breiden, te bestuderen en te differentiëren sterk nodig.
In het afgelopen decennium is een krachtige techniek om epitheelstamcellen in vitro te laten groeien met succes toegepast op verschillende soorten (menselijke) epitheelweefsels om hun biologie en ziekte 13,14,15,16 te bestuderen. Deze technologie stelt de weefselepitheelstamcellen in staat om zichzelf te ontwikkelen tot 3D-celconstructies (d.w.z. organoïden) wanneer ze worden gezaaid in een extracellulaire matrix (ECM) -nabootsende steiger (meestal Matrigel) en gekweekt in een gedefinieerd medium dat de stamcelnichesignalering en / of embryogenese van het weefsel repliceert. Typische groeifactoren die nodig zijn voor organoïde ontwikkeling zijn epidermale groeifactor (EGF) en vleugelloze MMTV-integratieplaats (WNT) activators 14,15,16. De resulterende organoïden worden gekenmerkt door blijvende trouw bij het nabootsen van de oorspronkelijke epitheelstamcellen van het weefsel, evenals een hoge uitbreidbaarheid met behoud van hun fenotype en functionele eigenschappen, waardoor de vaak beperkte beschikbaarheid van primair menselijk weefsel zoals verkregen uit de kliniek wordt overwonnen. Om organoïden vast te stellen, is isolatie van de epitheelstamcellen uit het heterogene weefsel (d.w.z. bestaande uit andere celtypen zoals mesenchymale cellen) voorafgaand aan het kweken niet vereist, omdat mesenchymale cellen zich niet hechten aan of gedijen in de ECM, wat uiteindelijk resulteert in zuiver epitheliale organoïden 13,16,17,18,19 . Deze veelbelovende en veelzijdige technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van vele organoïde modellen uit verschillende menselijke epitheelweefsels. Menselijke tand-afgeleide organoïden, waardevol voor diepgaande studie van tandontwikkeling, regeneratie en ziekte, waren echter nog niet vastgesteld20,21. We zijn er onlangs in geslaagd om zo’n nieuw organoïde model te ontwikkelen op basis van DF-weefsel uit derde kiezen (verstandskiezen) die zijn geëxtraheerd bij adolescente patiënten19.
Hier beschrijven we het protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen uit de volwassen menselijke tand (d.w.z. uit de DF van derde kiezen) (figuur 1A). De resulterende organoïden drukken ERM-geassocieerde stengelheidsmarkers uit terwijl ze op lange termijn uitbreidbaar zijn. Intrigerend genoeg is, in tegenstelling tot de meeste andere organoïde modellen, het typisch benodigde EFG overbodig voor robuuste organoïde ontwikkeling en groei. Interessant is dat de stamheidsorganoïden ameloblastdifferentiatie-eigenschappen vertonen, waardoor ERM / DESC-kenmerken en -processen in vivo worden nagebootst. Het nieuwe en unieke organoïde model dat hier wordt beschreven, maakt het mogelijk om DESC-biologie, plasticiteit en differentiatiecapaciteit te verkennen en opent de deur voor het zetten van de eerste stappen in de richting van tandregeneratieve benaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de efficiënte en reproduceerbare generatie van organoïden vanaf de menselijke tand. Voor zover wij weten, is dit de eerste methodologie voor het vaststellen van de huidige (epitheliale) organoïden, uitgaande van menselijk tandweefsel. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar en vertonen een tandepitheelstamfenotype, waarbij DESC’s worden gedupliceerd die eerder in het ERM-compartiment van de DF7 zijn gemeld. Bovendien repliceren de organoïden functionele DESC/ERM-kenm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn alle medewerkers van de Orale en Maxillofaciale Chirurgie (MKA) van UZ Leuven, alsook de patiënten, dankbaar voor hun onschatbare hulp bij het verzamelen van vers geëxtraheerde derde kiezen. We willen ook Dr. Reinhilde Jacobs en Dr. Elisabeth Tijskens bedanken voor hun hulp bij de monsterverzameling. Dit werk werd ondersteund door subsidies van KU Leuven (BOF) en FWO-Vlaanderen (G061819N). L.H. is een FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
Referências
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
