Établir les organoïdes de la dent humaine comme un outil puissant pour la recherche mécaniste et la thérapie régénérative
Summary
Nous présentons un protocole pour développer des cultures organoïdes épithéliales à partir de dents humaines. Les organoïdes sont solidement extensibles et récapitulent les cellules souches épithéliales de la dent, y compris leur capacité de différenciation des améloblastes. Le modèle organoïde unique fournit un outil prometteur pour étudier la biologie dentaire humaine (cellules souches) avec des perspectives pour les approches régénératrices des dents.
Abstract
Les dents sont d’une importance clé dans la vie non seulement pour la mastication des aliments et la parole, mais aussi pour le bien-être psychologique. Les connaissances sur le développement des dents humaines et la biologie sont rares. En particulier, on ne sait pas grand-chose sur les cellules souches épithéliales de la dent et leur fonction. Nous avons réussi à développer un nouveau modèle organoïde à partir de tissu dentaire humain (c.-à-d. follicule dentaire, isolé à partir de dents de sagesse extraites). Les organoïdes sont extensibles de manière robuste et à long terme et récapitulent le compartiment proposé des cellules souches épithéliales de la dent humaine en termes d’expression des marqueurs ainsi que d’activité fonctionnelle. En particulier, les organoïdes sont capables de déployer un processus de différenciation des améloblastes comme cela se produit in vivo au cours de l’amélogenèse. Ce modèle organoïde unique fournira un outil puissant pour étudier non seulement le développement des dents humaines, mais aussi la pathologie dentaire, et pourrait ouvrir la voie à une thérapie régénérative des dents. Remplacer les dents perdues par une dent biologique basée sur ce nouveau modèle organoïde pourrait être une alternative attrayante à l’implantation standard actuelle de matériaux synthétiques.
Introduction
Les dents ont des rôles essentiels dans la mastication des aliments, la parole et le bien-être psychologique (image de soi). La dent humaine est constituée de tissus hautement minéralisés de densité et de dureté variables1. L’émail dentaire, le composant principal de la couronne dentaire, est le tissu le plus minéralisé du corps humain. Au cours de la formation de l’émail (amélogenèse), lorsque les dents se développent, les cellules souches épithéliales dentaires (DESC) se différencient en cellules formant l’émail (améloblastes). Une fois formé, l’émail est rarement réparé ou renouvelé en raison de la perte apoptotique des améloblastes au début de l’éruption dentaire1. La restauration du tissu de l’émail endommagé, causé par un traumatisme ou une maladie bactérienne, est actuellement effectuée à l’aide de matériaux synthétiques; cependant, ceux-ci sont troublés par des lacunes importantes telles que le microlaçage, l’ostéointégration et l’ancrage inférieurs, la durée de vie limitée et le manque de réparation entièrement fonctionnelle2. Par conséquent, une culture robuste et fiable de DESC humains ayant la capacité de générer des améloblastes et le potentiel de produire des tissus minéralisés serait un grand pas en avant dans le domaine de la régénération dentaire.
Les connaissances sur le phénotype des DESC humain et la fonction biologique sont rares 3,4,5. Fait intéressant, il a été proposé que des DESC de dents humaines existent dans les restes de cellules épithéliales de Malassez (ERM), des amas de cellules présents dans le follicule dentaire (DF), qui entoure les dents non percées, et restent présents dans le ligament parodontal autour de la racine une fois que la dent éclate1. Il a été constaté que les cellules ERM co-cultivées avec la pulpe dentaire se différencient en cellules de type améloblaste et génèrent des tissus semblables à l’émail6. Cependant, les études approfondies sur le rôle spécifique des cellules ERM dans la (re-)génération de l’émail ont été limitées en raison de l’absence de modèles d’étude fiables7. Les systèmes actuels de culture in vitro ERM sont entravés par une durée de vie limitée et une perte rapide de phénotype dans les conditions 2D standardutilisées 8,9,10,11,12. Par conséquent, un système in vitro traitable pour développer, étudier et différencier fidèlement les DESC humains est fortement nécessaire.
Au cours de la dernière décennie, une technique puissante pour cultiver des cellules souches épithéliales in vitro a été appliquée avec succès à plusieurs types de tissus épithéliaux (humains) pour étudier leur biologie ainsi que la maladie 13,14,15,16. Cette technologie permet aux cellules souches épithéliales tissulaires de se développer elles-mêmes en constructions cellulaires 3D (c’est-à-dire des organoïdes) lorsqu’elles sont ensemencées dans un échafaudage imitant la matrice extracellulaire (ECM) (typiquement, Matrigel) et cultivées dans un milieu défini répliquant la signalisation de niche de cellules souches et / ou l’embryogenèse du tissu. Les facteurs de croissance typiques nécessaires au développement organoïde comprennent le facteur de croissance épidermique (EGF) et les activateurs du site d’intégration MMTV (WNT) de type sans ailes 14,15,16. Les organoïdes résultants se caractérisent par une fidélité durable dans l’imitation des cellules souches épithéliales originales du tissu, ainsi que par une grande extensibilité tout en conservant leur phénotype et leurs propriétés fonctionnelles, surmontant ainsi la disponibilité souvent limitée des tissus humains primaires acquis à la clinique. Pour établir des organoïdes, l’isolement des cellules souches épithéliales du tissu hétérogène (c.-à-d. comprenant d’autres types de cellules telles que les cellules mésenchymateuses) avant la culture n’est pas nécessaire car les cellules mésenchymateuses ne s’attachent pas à l’ECM ou ne s’y développent pas, ce qui aboutit éventuellement à des organoïdes purement épithéliaux 13,16,17,18,19 . Cette technologie prometteuse et polyvalente a conduit au développement de nombreux modèles organoïdes à partir de divers tissus épithéliaux humains. Cependant, les organoïdes dérivés des dents humaines, précieux pour l’étude approfondie du développement, de la régénération et de la maladie des dents, n’ont pas encore été établis20,21. Nous avons récemment réussi à développer un tel nouveau modèle organoïde à partir de tissu DF de troisièmes molaires (dents de sagesse) extraites de patients adolescents19.
Nous décrivons ici le protocole pour développer des cultures organoïdes épithéliales à partir de la dent humaine adulte (c.-à-d. à partir du DF des troisièmes molaires) (Figure 1A). Les organoïdes résultants expriment des marqueurs de tige associés à ERM tout en étant extensibles à long terme. Curieusement, contrairement à la plupart des autres modèles organoïdes, l’EGF généralement nécessaire est redondant pour un développement et une croissance organoïdes robustes. Fait intéressant, les organoïdes de la tige présentent des propriétés de différenciation des améloblastes, imitant ainsi les caractéristiques et les processus ERM / DESC se produisant in vivo. Le nouveau modèle organoïde unique décrit ici permet d’explorer la biologie, la plasticité et la capacité de différenciation du DESC et ouvre la porte aux premiers pas vers des approches de régénération des dents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit la génération efficace et reproductible d’organoïdes à partir de la dent humaine. À notre connaissance, il s’agit de la première méthodologie permettant d’établir des organoïdes à concept actuel (épithéliaux) à partir de tissu dentaire humain. Les organoïdes sont extensibles à long terme et présentent un phénotype de tige épithéliale dentaire, dupliquant les DESC précédemment signalés dans le compartiment ERM du DF7. De plus, les organoïdes reprodu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à tous les membres du personnel de la chirurgie buccale et maxillo-faciale (MKA) de l’UZ Leuven, ainsi qu’aux patients, pour leur aide inestimable dans la collecte des troisièmes molaires fraîchement extraites. Nous tenons également à remercier la Dre Reinhilde Jacobs et la Dre Elisabeth Tijskens pour leur aide dans la collecte d’échantillons. Ce travail a été soutenu par des subventions de la KU Leuven (BOF) et de FWO-Flanders (G061819N). L.H. est titulaire d’un doctorat FWO (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
Referências
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