Establecer organoides a partir de dientes humanos como una herramienta poderosa hacia la investigación mecanicista y la terapia regenerativa
Summary
Presentamos un protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir de dientes humanos. Los organoides son robustamente expandibles y recapitulan las células madre epiteliales del diente, incluida su capacidad de diferenciación de ameloblastos. El modelo organoide único proporciona una herramienta prometedora para estudiar la biología dental humana (células madre) con perspectivas para enfoques regenerativos de dientes.
Abstract
Los dientes son de importancia clave en la vida no solo para la masticación de los alimentos y el habla, sino también para el bienestar psicológico. El conocimiento sobre el desarrollo de los dientes humanos y la biología es escaso. En particular, no se sabe mucho sobre las células madre epiteliales del diente y su función. Logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido dental humano (es decir, folículo dental, aislado de muelas del juicio extraídas). Los organoides son expandibles de forma robusta y a largo plazo y recapitulan el compartimento de células madre epiteliales del diente humano propuesto en términos de expresión de marcadores, así como de actividad funcional. En particular, los organoides son capaces de desplegar un proceso de diferenciación de ameloblastos como ocurre in vivo durante la amelogénesis. Este modelo organoide único proporcionará una herramienta poderosa para estudiar no solo el desarrollo de los dientes humanos, sino también la patología dental, y puede allanar el camino hacia la terapia regenerativa dental. Reemplazar los dientes perdidos con un diente biológico basado en este nuevo modelo de organoides podría ser una alternativa atractiva a la implantación estándar actual de materiales sintéticos.
Introduction
Los dientes tienen funciones esenciales en la masticación de los alimentos, el habla y el bienestar psicológico (autoimagen). El diente humano consiste en tejidos altamente mineralizados de densidad y dureza variables1. El esmalte dental, el componente principal de la corona dental, es el tejido mineralizado más alto del cuerpo humano. Durante la formación del esmalte (amelogénesis), cuando se desarrollan los dientes, las células madre epiteliales dentales (DESC) se diferencian en células formadoras de esmalte (ameloblastos). Una vez formado, el esmalte rara vez se repara o renueva debido a la pérdida apoptótica de los ameloblastos al inicio de la erupción dental1. La restauración del tejido del esmalte dañado, causado por un traumatismo o enfermedad bacteriana, se realiza actualmente utilizando materiales sintéticos; sin embargo, estos están preocupados por deficiencias importantes como la microcongestión, la osteointegración y el anclaje inferiores, la vida útil finita y la falta de reparación completamente funcional2. Por lo tanto, un cultivo robusto y confiable de DESC humanos con la capacidad de generar ameloblastos y el potencial de producir tejido mineralizado sería un gran paso adelante en el campo de la regeneración dental.
El conocimiento sobre el fenotipo DELSC humano y la función biológica son escasos 3,4,5. Curiosamente, se ha propuesto que los DESC de los dientes humanos existen en los restos de células epiteliales de Malassez (ERM), grupos celulares presentes dentro del folículo dental (DF), que rodea los dientes no erupcionados y permanece presente en el ligamento periodontal alrededor de la raíz una vez que el diente entra en erupción1. Se ha encontrado que las células ERM cocultivadas con pulpa dental se diferencian en células similares a los ameloblastos y generan tejido similar al esmalte6. Sin embargo, los estudios profundos sobre el papel específico de las células ERM en la (re)generación de esmalte han sido limitados debido a la falta de modelos de estudio confiables7. Los sistemas actuales de cultivo in vitro ERM se ven obstaculizados por la vida útil limitada y la rápida pérdida de fenotipo en las condiciones 2D utilizadas estándarmente 8,9,10,11,12. Por lo tanto, se necesita un sistema in vitro manejable para expandir, estudiar y diferenciar fielmente los DESC humanos.
Durante la última década, una poderosa técnica para cultivar células madre epiteliales in vitro se ha aplicado con éxito a varios tipos de tejidos epiteliales (humanos) para estudiar su biología, así como la enfermedad 13,14,15,16. Esta tecnología permite que las células madre epiteliales tisulares se desarrollen automáticamente en construcciones de células 3D (es decir, organoides) cuando se siembran en un andamio que imita la matriz extracelular (ECM) (típicamente, Matrigel) y se cultivan en un medio definido que replica la señalización del nicho de células madre del tejido y / o la embriogénesis. Los factores de crecimiento típicos necesarios para el desarrollo de organoides incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y los activadores del sitio de integración MMTV (WNT) de tipo sin alas 14,15,16. Los organoides resultantes se caracterizan por una fidelidad duradera en la imitación de las células madre epiteliales originales del tejido, así como una alta capacidad de expansión al tiempo que conservan su fenotipo y propiedades funcionales, superando así la disponibilidad de tejido humano primario a menudo limitada adquirida en la clínica. Para establecer organoides, no se requiere el aislamiento de las células madre epiteliales del tejido heterogéneo (es decir, que comprende otros tipos de células, como las células mesenquimales) antes del cultivo, ya que las células mesenquimales no se adhieren o prosperan en la ECM, lo que eventualmente resulta en organoides puramente epiteliales 13,16,17,18,19 . Esta tecnología prometedora y versátil ha llevado al desarrollo de múltiples modelos organoides a partir de diversos tejidos epiteliales humanos. Sin embargo, los organoides derivados de dientes humanos, valiosos para el estudio profundo del desarrollo, la regeneración y la enfermedad de los dientes, aún no se han establecido20,21. Recientemente logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido DF a partir de terceros molares (muelas del juicio) extraídos de pacientes adolescentes19.
Aquí, describimos el protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir del diente humano adulto (es decir, a partir del DF de terceros molares) (Figura 1A). Los organoides resultantes expresan marcadores de tallo asociados a ERM mientras que son expandibles a largo plazo. Curiosamente, a diferencia de la mayoría de los otros modelos de organoides, el EGF típicamente necesario es redundante para el desarrollo y crecimiento de organoides robustos. Curiosamente, los organoides del tallo muestran propiedades de diferenciación de ameloblastos, imitando así las características y procesos de ERM / DESC que ocurren in vivo. El nuevo y único modelo organoide descrito aquí permite explorar la biología, la plasticidad y la capacidad de diferenciación de DESC y abre la puerta para dar los primeros pasos hacia enfoques regenerativos de los dientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la generación eficiente y reproducible de organoides a partir del diente humano. Hasta donde sabemos, esta es la primera metodología para establecer organoides de concepto actual (epitelial) a partir de tejido dental humano. Los organoides son expandibles a largo plazo y muestran un fenotipo de tallo epitelial dental, duplicando los DESC previamente reportados en el compartimiento ERM del DF7. Además, los organoides replican las características funcionales de DESC/ERM, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros del personal de Cirugía Oral y Maxilofacial (MKA) de UZ Leuven, así como a los pacientes, por su inestimable ayuda en la recolección de terceros molares recién extraídos. También nos gustaría agradecer a la Dra. Reinhilde Jacobs y a la Dra. Elisabeth Tijskens por su ayuda con la recolección de muestras. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de KU Leuven (BOF) y FWO-Flanders (G061819N). L.H. es un FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
Referências
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