Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

Summary

Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.

Abstract

Os dentes são de fundamental importância na vida não só para a mastigação alimentar e a fala, mas também para o bem-estar psicológico. O conhecimento sobre desenvolvimento dentário humano e biologia é escasso. Em particular, pouco se sabe sobre as células-tronco epiteliais do dente e sua função. Conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido dentário humano (ou seja, folículo dentário, isolado dos dentes do siso extraído). Os organoides são robustos e expansíveis a longo prazo e recapitulam o compartimento de células-tronco do dente humano proposto em termos de expressão de marcador, bem como atividade funcional. Em particular, os organoides são capazes de desdobrar um processo de diferenciação ameloblast como ocorre in vivo durante a amelogênese. Este modelo organoide único fornecerá uma ferramenta poderosa para estudar não apenas o desenvolvimento dentário humano, mas também a patologia dentária, e pode abrir caminho para a terapia regenerativa dentária. Substituir dentes perdidos por um dente biológico baseado neste novo modelo organoide pode ser uma alternativa atraente para a implantação padrão atual de materiais sintéticos.

Introduction

Os dentes têm papéis essenciais na mastigação alimentar, fala e bem-estar psicológico (autoimagem). O dente humano consiste em tecidos altamente mineralizados de densidade e dureza^{variadas 1}. O esmalte dentário, o principal componente da coroa dentária, é o tecido mineralizado mais alto do corpo humano. Durante a formação do esmalte (amelogênese), quando os dentes se desenvolvem, as células-tronco epiteliais dentárias (DESCs) se diferenciam em células formadoras de esmalte (ameloblasts). Uma vez formado, o esmalte raramente é reparado ou renovado devido à perda apoptótica dos ameloblastas no início da erupção dentária¹. ....

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa UZ/KU Leuven (13/0104U). Os terceiros molares extraídos (dentes do siso) foram obtidos após o consentimento informado dos pacientes.

1. Preparativos

1. Pré-aquecimento uma placa de cultura de 48 poços para 15-20 h em uma incubadora de CO₂ de 1,9% a 37 °C.
2. Liquefazer uma alíquota de Matrigel (fator de crescimento reduzido; livre de fenol; ainda mais referida como matriz de membrana do porão; BMM) no gelo (4 °C) pela mínima de 2h antes da etapa 2.1.
   NOTA: Evite ciclos de congelamento/degelo do BMM. Liquefafique o BM....

Results

Desenvolvimento organoide dentário
Fornecemos um protocolo detalhado para estabelecer culturas organoides a partir do tecido DF humano adquirido após a extração do dente do siso (Figura 1A). O DF isolado é enzimaticamente e mecanicamente dissociado. As células obtidas são cultivadas dentro da BMM em mídias que foram empiricamente definidas para o desenvolvimento e crescimento organoide ideal (meio organoide dentário; TOM)¹⁹.

Discussion

Este protocolo descreve a geração eficiente e reprodutível de organoides a partir do dente humano. Para nosso conhecimento, esta é a primeira metodologia para o estabelecimento de organoides de conceito atual (epitelial) a partir do tecido dentário humano. Os organoides são expansíveis a longo prazo e apresentam um fenótipo de caule epitelial dentário, duplicando DESCs previamente relatados no compartimento ERM do DF⁷. Além disso, os organoides replicam características funcionais de DESC/ERM, incl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	30120.086
Tubo de centrífuga de 15 mL	Corning	430052
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M-6250
Placas de fundo plano de 48 poços	Corning	3548
Tubo de centrífuga de 50 mL	Corning	430290
A83-01	Sigma-Aldrich
Agarose	Lonza	50004
Albumina Bovina (grau de cultura celular)	Serva	47330.03
AMELX anticorpo	Santa Cruz	sc-365284
Anfotericina B	Gibco	15200018
B27 (sem vitamina A)	Gibco	12587-010
	VWR
Catalase de fígado bovino	Sigma-Aldrich	C100
CD44 anticorpo	Abcam	ab34485
Filtro de células, 40 µ m	Falcon	352340
Toxina da cólera	Sigma-Aldrich	C8052
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C0759
CK14 anticorpo	Thermo Fisher Scientific	MA5-11599
Colagenase IV	Gibco	17104-019
Vidro de cobertura	VWR	6310146
Cryobox	Thermo Scientific	5100-0001
Cryovial	Thermo Fisher Scientific	375353
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMEM 1:1 F12 sem Fe	Invitrogen	074-90715A
DMEM pó alta glicose	Gibco	52100039
Dnase	Sigma-Aldrich	D5025-15KU
Soro de burro	Sigma-Aldrich	D9663 - 10ML
Estação de trabalho de embutimento, 220 a 240 Vac	Thermo Fisher Scientific	12587976
Etanol absoluto, ≥ 99,8% (EtOH)	Fisher Chemical	E / 0650DF / 15
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
FGF10	Peprotech	100-26
FGF2 (= FGF básico)	R & D Systems	234-FSE-025
FGF8	Peprotech	AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	RTN350-1KT	Inclui 1% de β-mercaptoetanol dissolvido em tampão de lise
Pipeta de vidro Pasteur	Niko Mechanisms	170-40050
Glycine	VWR	101194M
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
IGF-1	PeproTech	100-11
InSolution Y-27632 (inibidor de ROCK, RI)	Sigma-Aldrich	688001
Insulina do pâncreas	bovino Sigma-Aldrich	I6634
ITGA6 anticorpo	Sigma-Aldrich	HPA012696
L-Glutamina	Gibco	25030024
Matrigel (fator de crescimento reduzido; sem fenol vermelho)	Corning	15505739
lâmina de microscópio	Millex-GV J1800AMNZ		Thermo Fisher Scientific
, 0.22  μ m	Millipore	SLGV033R
Águia média essencial mínima (α MEM)	Sigma-Aldrich	M4526
camundongo IgG (Alexa 555) anticorpo secundário	Thermo Fisher Scientific	A-31570
N2	Gibco	17502-048
N-acetil L-cisteína	Sigma-Aldrich	A7250
Nicotinamida	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	120-10C
Anticorpo P63	Abcam	ab124762
Pap Pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Caneta de marcação
Paraformaldeído (PFA), 16%	Merck	8.18715
Penicilina G sal de sódio	Sigma-Aldrich	P3032
Penicilina-estreptomicina (Pen / Strep)	Gibco	15140-122
Placa	de PetriCorning	353002
Fosfato tampolado com solução salina (PBS)	Gibco	10010-015
Pipeta (P20, P200, P1000)	Eppendorf ou outros	2231300006
Pipeta de transferência de plástico (3.5  mL)	Sarstedt	86.1171.001
Coelho IgG (Alexa 488) anticorpo secundário	Thermo Fisher Scientific	A21206
RSPO1	PeproTech	120-38
SB202190 (p38i)	Biotechne (Tocris)	1264
Bisturi (lâmina cirúrgica)	Swann-Morton	207
SHH	R & D Systems	464-SH-200
Moldes de silicone (bloco de aquecimento)	VWR	720-1918
Cloreto de sódio (NaCl)	BDH	102415K
Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3)	Merck	106329
piruvato de sódio (C3H3NaO3)	Sigma-Aldrich	P-5280
Anticorpo SOX2	Abcam	ab92494
StepOnePlus	Thermo Fisher Scientific		de PCR em Tempo Real
Stericup-GP, 0.22 µ m	Millipore	SCGPU02RE
Steriflip-GP Unidade de Filtro Superior de Tubo de Centrífuga Estéril, 0.22 μ m	Millipore	SCGP00525
Estéril 1000 μ L ponteiras de pipeta com filtro	Greiner	740288
Sterile 20 μ L ponteiras de pipeta com filtro	Greiner	774288
Sterile 200 μ L ponteiras de pipeta com e sem filtro	Greiner	739288
Estéril H2O	Fresenius	B230531
Sal de sulfato de estreptomicina	Sigma-Aldrich	S6501
Superscript III supermix de síntese de primeira fita	Invitrogen	11752-050	Kit de transcrição reversa
Processador de tecidos	Thermo Scientific
Transferrin	Serva	36760.01
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
TrypLE express	Gibco	12605-010
Meio de montagem Vectashield+DAPI	Labconsult NV	H-1200	Meio de montagem antifade com DAPI
WNT3a	Biotechne (Tocris)	5036-WN-500
Xilenos, 99%, para bioquímica e histologia	VWR	2,89,75,325