Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias
Summary
El protocolo presenta un método para derivar organoides pulmonares humanos a partir de tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenopicon fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas.
Abstract
La falta de un modelo robusto in vitro del epitelio respiratorio humano dificulta la comprensión de la biología y la patología del sistema respiratorio. Describimos un protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos a partir de células madre adultas en el tejido pulmonar e inducir la diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias. Los organoides pulmonares se expanden consecutivamente durante más de 1 año con alta estabilidad, mientras que los organoides diferenciados de las vías respiratorias se utilizan para simular morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico. Así, establecemos un modelo organoide robusto del epitelio de la vía aérea humana. La expansión a largo plazo de los organoides pulmonares y los organoides diferenciados de las vías respiratorias genera una fuente estable y renovable, lo que permite a los científicos reconstruir y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias humanas en platos de cultivo. El sistema organoide pulmonar humano proporciona un modelo in vitro único y fisiológicamente activo para diversas aplicaciones, incluido el estudio de la interacción virus-huésped, las pruebas de medicamentos y el modelado de enfermedades.
Introduction
Los organoides se han convertido en una herramienta robusta y universal para el modelado in vitro del desarrollo de órganos y el estudio de la biología y la enfermedad. Cuando se cultivan en un medio de cultivo definido por el factor de crecimiento, las células madre adultas (ASC) de una variedad de órganos pueden expandirse en 3 dimensiones (3D) y autoensamblarse en grupos celulares similares a órganos compuestos de múltiples tipos de células, denominados organoides. El laboratorio de Clevers informó de la derivación del primer organoide derivado de ASC, el organoide intestinal humano, en 2009 1,2. Posteriormente, se han establecido organoides derivados de ASC para una variedad de órganos y tejidos humanos, incluyendo próstata 3,4, hígado 5,6, estómago 7,8,9, páncreas10, glándula mamaria11 y pulmón 12,13 . Estos organoides derivados de ASC conservaron las propiedades celulares, estructurales y funcionales críticas del órgano nativo y mantuvieron la estabilidad genética y fenotípica en cultivos de expansión a largo plazo14,15.
Los organoides también pueden derivarse de células madre pluripotentes (PSC), incluidas las células madre embrionarias (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS)16. Mientras que los organoides derivados de PSC explotan los mecanismos de desarrollo de órganos para su establecimiento, los ASC pueden ser coaccionados para formar organoides mediante la reconstrucción de condiciones que imitan el nicho de células madre durante la autorrenovación fisiológica del tejido o la reparación de tejidos. Los organoides derivados de PSC son modelos favorables para explorar el desarrollo y la organogénesis, aunque no pueden alcanzar el nivel de maduración comparable de los organoides derivados de ASC. El estado de maduración similar al fetal de los organoides derivados de PSC y la complejidad para establecer estos organoides impiden sustancialmente sus amplias aplicaciones para estudiar la biología y la patología en tejidos maduros.
El tracto respiratorio humano, desde la nariz hasta el bronquiolo terminal, está revestido con el epitelio de las vías respiratorias, también llamado epitelio ciliado pseudoestratificado, que consta de cuatro tipos principales de células, es decir, células ciliadas, células caliciformes, células basales y células club. Establecimos el organoide pulmonar humano derivado de ASC a partir de tejidos pulmonares humanos en colaboración con el laboratorio12,13 de Clevers. Estos organoides pulmonares se expanden consecutivamente en el medio de expansión durante más de un año; la duración precisa varía entre las diferentes líneas organoides obtenidas de diferentes donantes. Sin embargo, en comparación con el epitelio nativo de las vías respiratorias, estos organoides pulmonares expandibles a largo plazo no son lo suficientemente maduros ya que las células ciliadas, la principal población celular en las vías respiratorias humanas, están subrepresentadas en estos organoides pulmonares. Así, desarrollamos un protocolo de diferenciación proximal y generamos organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenocopian morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias a un nivel casi fisiológico.
Aquí proporcionamos un protocolo de video para derivar organoides pulmonares humanos de los tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las vías respiratorias humanas están revestidas con el epitelio de las vías respiratorias, también conocido como epitelio ciliado pseudoestratificado. Los principales tipos de células del epitelio de las vías respiratorias superiores son las células ciliadas que permiten el movimiento coordinado de sus cilios apicales para expulsar el moco y las partículas inhaladas de las vías respiratorias, las células caliciformes que producen y secretan moco y las células basales que recubren la membrana basal y están imp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Centro de Ciencias Panorómicas y a la Unidad de Microscopio Electrónico, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, por su asistencia en imágenes confocales y citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos del Fondo de Salud e Investigación Médica (HMRF, 17161272 y 19180392) de la Oficina de Alimentos y Salud; Fondo General de Investigación (GRF, 17105420) del Consejo de Becas de Investigación; y Health@InnoHK, Comisión de Innovación y Tecnología, el Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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