रिवर्स जेनेटिक्स से मिलेगा पॉजिटिव सेंस आरएनए वायरस वेरिएंट
Summary
प्रोटोकॉल त्रुटि-प्रवण पीसीआर और रिवर्स जेनेटिक्स का उपयोग करके पूर्ण लंबाई वाले उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण के संयोजन से हेपेटाइटिस सी वायरस जीनोम में नियंत्रणीय आनुवंशिक विविधता पेश करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विधि फेनोटाइप चयन के लिए एक मॉडल प्रदान करती है और इसका उपयोग 10 केबी लंबे सकारात्मक-सेंस आरएनए वायरस जीनोम के लिए किया जा सकता है।
Abstract
विविध पूर्ण लंबाई वाले वायरल वेरिएंट की पुनरावृत्ति पीढ़ी के लिए एक सुविधाजनक विधि की कमी ने आरएनए वायरस में निर्देशित विकास के अध्ययन को बाधित किया है। एक पूर्ण आरएनए जीनोम त्रुटि-प्रवण पीसीआर और रिवर्स जेनेटिक्स को एकीकृत करके, यादृच्छिक जीनोम-व्यापक प्रतिस्थापन म्यूटेनेसिस को प्रेरित किया जा सकता है। हमने इस तकनीक का उपयोग करके विभिन्न पुस्तकालयों को संश्लेषित करने के लिए एक विधि विकसित की है ताकि रुचि के फेनोटाइप के साथ वायरल म्यूटेंट की पहचान की जा सके। यह विधि, जिसे पूर्ण लंबाई उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण (एफएल-एमआरएस) कहा जाता है, निम्नलिखित लाभ प्रदान करता है: (i) अत्यधिक कुशल एक-चरण त्रुटि-प्रवण पीसीआर के माध्यम से एक बड़ी लाइब्रेरी बनाने की क्षमता; (ii) डीएनए पोलीमरेज़ की निष्ठा में हेरफेर करके आनुवंशिक विविधता के विभिन्न स्तरों के साथ पुस्तकालयों के समूह बनाने की क्षमता; (iii) एक पूर्ण लंबाई वाले पीसीआर उत्पाद का निर्माण जो सीधे उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम कर सकता है; और (iv) आरएनए बनाने की क्षमता जिसे वांछित फेनोटाइप के वायरल उत्परिवर्ती की जांच के लिए गैर-चयनित इनपुट पूल के रूप में मेजबान कोशिकाओं में वितरित किया जा सकता है। हमने रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण का उपयोग करके पाया है कि एफएल-एमआरएस हेपेटाइटिस सी वायरस के जीवन चक्र में सभी चरणों में वायरल-निर्देशित विकास का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण है। यह तकनीक अनुकूलन, प्रतिकृति और सकारात्मक भावना आरएनए वायरस में रोगजनन और एंटीवायरल प्रतिरोध में वायरल जीन की भूमिका को समझने के लिए निर्देशित विकास को नियोजित करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रतीत होती है।
Introduction
फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीनिंग रुचि के वायरल फेनोटाइप से शुरू होती है और फिर, इसके जीनोम को अनुक्रमित करने और मूल तनाव से तुलना करने के माध्यम से, उस फेनोटाइप के कारण उत्परिवर्तन (ओं) की पहचान करने का प्रयास करती है। इसके विपरीत, रिवर्स जेनेटिक स्क्रीन में, एक लक्ष्य जीन में यादृच्छिक उत्परिवर्तन पेश किए जाते हैं, इसके बाद परिणामी फेनोटाइप (एस) 1 की परीक्षा होती है। रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण के लिए, इन विट्रो म्यूटेनेसिस वेरिएंट का एक पूल बनाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है जिसे बाद में रुचि के फेनोटाइप के लिए जांच की जाती है। आरएनए वायरस के जीनोम-वाइड रैंडम म्यूटेनेसिस को प्राप्त करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक उपकरणों की सूचना दी गई है, जिसमें त्रुटि-प्रवण पीसीआर (ईपी-पीसीआर) 2,3, सर्कुलर पोलीमरेज़ एक्सटेंशन4, और म्यू-ट्रांसपोसन सम्मिलन म्यूटेनेसिस 5,6,7 शामिल हैं। बाद के दो तरीकों से पुस्तकालयों में सीमित अनुक्रम विविधता होती है और बड़े सम्मिलन और विलोपन की शुरूआत का खतरा होता है, जो वायरस के लिए अत्यधिक घातक होते हैं और संक्रामक वायरल वेरिएंट की वसूली को गंभीर रूप से सीमित करते हैं।
ईपी-पीसीआर एक प्रसिद्ध शक्तिशाली म्यूटेनेसिस तकनीक है जिसका व्यापक रूप से प्रोटीन इंजीनियरिंग में वांछित गुणों के साथ फेनोटाइप के चयन के लिए उत्परिवर्ती एंजाइम उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि बढ़ी हुई थर्मल स्थिरता, सब्सट्रेट विशिष्टता और उत्प्रेरक गतिविधि 8,9,10। यह तकनीक प्रदर्शन करना आसान है क्योंकि इसमें सरल उपकरणों की आवश्यकता होती है, इसमें थकाऊ जोड़तोड़ शामिल नहीं है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करता है, और त्वरित है; इसके अलावा, यह उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालय उत्पन्न करता है।
यहां, हमने ईपी-पीसीआर को एकीकृत करके हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) के पूर्ण जीनोम उत्पन्न करने के लिए पूर्ण लंबाई वाले उत्परिवर्ती आरएनए संश्लेषण (एफएल-एमआरएस) के लिए एक नई विधि विकसित की, जो यादृच्छिक जीनोम-वाइड प्रतिस्थापन म्यूटेनेसिस और रिवर्स जेनेटिक्स को प्रेरित करती है। यहां तक कि एक एकल न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन या विलोपन सकारात्मक-भावना आरएनए वायरस ([+] एसएसआरएनए) के लिए अत्यधिक हानिकारक है; इसलिए, पीसीआर-आधारित प्रतिस्थापन म्यूटेनेसिस अच्छी व्यवहार्यता के साथ पूर्ण (+) एसएस आरएनए वायरस जीनोम के बड़े, विविध पुस्तकालयों की पुनरावृत्ति पीढ़ी के लिए पसंदीदा तरीका है।
एफएल-एमआरएस एक सीधा दृष्टिकोण है जिसे वायरल सीडीएनए क्लोन को बांधने वाले प्राइमर सेट के सावधानीपूर्वक डिजाइन के माध्यम से ~ 10 केबी जीनोम लंबाई के साथ किसी भी सकारात्मक-भावना आरएनए वायरस पर लागू किया जा सकता है। पीजेएफएच 1 एक संक्रामक सीडीएनए क्लोन है जो एचसीवी जीनोटाइप 2 ए को एन्कोड करता है और वायरस जीवन चक्र के सभी चरणों को पुन: उत्पन्न कर सकता है। एफएल-एमआरएस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हमने प्रतिकृति-सक्षम जेएफएच 1 वेरिएंट का उत्पादन करने के लिए यादृच्छिक रूप से उत्परिवर्तित पूर्ण-जीनोम पुस्तकालयों (उत्परिवर्ती पुस्तकालयों [एमएल]) के संश्लेषण का प्रदर्शन किया, जिसके लिए उत्परिवर्तन से जुड़े गुणों का कोई पूर्व ज्ञान नहीं था। एक एंटीवायरल के संपर्क में आने पर, कुछ वायरल वेरिएंट ने वांछित फेनोटाइपिक परिवर्तन के साथ दवा के दबाव को जल्दी से पार कर लिया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, वायरल वेरिएंट की अधिकता उत्पन्न की जा सकती है, जिससे (+) एसएसआरएनए वायरस के विकास का अध्ययन करने के अवसर पैदा होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने एक सरल और तेजी से एफएल-एमआरएस प्रक्रिया का विस्तार किया है जो एचसीवी पूर्ण-जीनोम पुस्तकालयों को संश्लेषित करने के लिए ईपी-पीसीआर18 और रिवर्स जेनेटिक्स को एकीकृत करता है, जिस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के लिए वित्त पोषण सहायता (अनुदान संख्या बीटी/PR10906/एमईडी/29/860/2014) जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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