Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution
Summary
La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.
Abstract
Le dysfonctionnement mitochondrial dans les nerfs périphériques accompagne plusieurs maladies associées à la neuropathie périphérique, qui peuvent être déclenchées par de multiples causes, notamment les maladies auto-immunes, le diabète, les infections, les troubles héréditaires et les tumeurs. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques de la souris peut être difficile en raison de la petite taille de l’échantillon, d’un nombre limité de mitochondries présentes dans le tissu et de la présence d’une gaine de myéline. La technique décrite dans ce travail minimise ces défis en utilisant un protocole de perméabilisation unique adapté de celui utilisé pour les fibres musculaires, pour évaluer la fonction mitochondriale du nerf sciatique au lieu d’isoler les mitochondries du tissu. En mesurant la production d’espèces réactives fluorimétriques avec Amplex Red/Peroxyidase et en comparant différents substrats mitochondriaux et inhibiteurs dans les nerfs perméabilisés par la saponine, il a été possible de détecter simultanément les états respiratoires mitochondriaux, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’activité des complexes mitochondriaux. Par conséquent, la méthode présentée ici offre des avantages par rapport à l’évaluation de la fonction mitochondriale par d’autres techniques.
Introduction
Les mitochondries sont essentielles au maintien de la viabilité cellulaire et remplissent de nombreuses fonctions cellulaires telles que le métabolisme énergétique (voies de métabolisme du glucose, des acides aminés, des lipides et des nucléotides). En tant que site principal de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), les mitochondries sont au centre de plusieurs processus de signalisation cellulaire tels que l’apoptose et participent à la synthèse des amas fer-soufre (Fe-S), à l’importation et à la maturation des protéines mitochondriales et au maintien de leur génome et de leurs ribosomes 1,2,3. Le réseau de dynamique de la membrane mitochondriale est contrôlé par des processus de fusion et de fission, et ils ont également des machines pour le contrôle de la qualité et la mitophagie 4,5,6.
Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à l’apparition de plusieurs conditions pathologiques telles que le cancer, le diabète et l’obésité7. Des perturbations de la fonction mitochondriale sont détectées dans les troubles neurodégénératifs qui affectent le système nerveux central, comme dans la maladie d’Alzheimer 8,9, la maladie de Parkinson 10,11, la sclérose latérale amyotrophique 12,13 et la maladie de Huntington 14,15 . Dans le système nerveux périphérique, une perte de la fonction mitochondriale dans les axones est observée dans les neuropathies immunitaires, telles que le syndrome de Guillain-Barré16,17, et en association avec une production élevée de ROS mitochondrial dans les axones, ces événements conduisent à l’activation de la MAP Kinase dans les cellules de Schwann18. Cela démontre que la physiologie mitochondriale peut être essentielle non seulement pour une cellule spécifique au site, mais pour un tissu entier. Dans la polyneuropathie sensorielle distale associée au VIH (HIV-DSP), les mitochondries jouent un rôle dans le mécanisme par lequel la protéine trans-activateur de transcription (HIV-TAT) permet au VIH de se répliquer efficacement, ainsi que plusieurs autres rôles dans la pathogenèse de l’infection par le VIH19,20.
L’évaluation de la physiologie mitochondriale du nerf sciatique est devenue une cible essentielle pour étudier la neuropathie 7,21,22. Dans la neuropathie diabétique, les analyses protéomiques et métabolomiques suggèrent que la plupart des altérations moléculaires du diabète affectent la phosphorylation oxydative mitochondriale du nerf sciatique et le métabolisme des lipides7. Ces altérations semblent également être des signes précoces de diabète induit par l’obésité21. Dans un modèle murin de neuropathie douloureuse induite par la chimiothérapie, une altération mitochondriale du nerf sciatique est détectée comme une diminution de la phosphorylation oxydative22 et une réduction des activités des complexes mitochondriaux, du potentiel membranaire et de la teneur en ATP23. Cependant, bien que plusieurs groupes aient cité le dysfonctionnement mitochondrial dans les neuropathies, ces études se limitent aux mesures de l’activité dans les complexes mitochondriaux sans préservation des membranes mitochondriales, sans évaluation de l’intégrité mitochondriale ou mesures de la teneur en ATP comme paramètre de la production mitochondriale d’ATP. En général, une évaluation correcte de la consommation mitochondriale d’oxygène et de la production de ROS nécessite l’isolement des mitochondries par centrifugation différentielle dans un gradient percoll/saccharose. L’isolement des mitochondries peut également être un facteur limitant pour le tissu nerveux sciatique en raison de la grande quantité de tissu nécessaire et de la perte et de la perturbation des mitochondries.
La présente étude vise à fournir un protocole pour mesurer la physiologie mitochondriale comme la consommation d’oxygène mitochondrial et la production de ROS dans le nerf sciatique, en préservant les membranes mitochondriales et sans qu’il soit nécessaire d’isoler les mitochondries. Ce protocole est adapté des mesures de consommation d’oxygène dans les fibres musculaires perméabilisées24 par respirométrie à haute résolution (HRR). Les avantages de cette procédure sont la possibilité d’évaluer les mitochondries dans de petites quantités de tissus tels que le nerf sciatique et d’évaluer les paramètres mitochondriaux in situ, préservant ainsi l’environnement mitochondrial, la structure et le profil bioénergétique, pour obtenir un résultat physiologiquement fiable. Les états respiratoires mitochondriaux ont été déterminés avec des substrats et des inhibiteurs après la perméabilisation du nerf sciatique afin d’évaluer correctement la bioénergétique mitochondriale et le coefficient cytochrome c pour l’intégrité de la membrane mitochondriale, fournissant un guide pour les étapes de l’évaluation du système de transport d’électrons mitochondrial (ETS) et le calcul des paramètres essentiels. Cette étude peut fournir des outils pour répondre aux questions sur les mécanismes physiopathologiques dans lesquels le métabolisme du nerf sciatique est impliqué, tels que les neuropathies périphériques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs maladies ou affections accompagnant les neuropathies ont un dysfonctionnement mitochondrial comme facteur de risque. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques est essentielle pour élucider comment les mitochondries agissent dans ces conditions neurodégénératives. L’évaluation de la fonction mitochondriale est laborieuse en raison de la difficulté de la méthode d’isolement et de la rareté du matériel. Ainsi, le développement de techniques de perméabilisation tiss…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par l’Instituto Serrapilheira, la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) et le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Nous sommes reconnaissants au Dr Antonio Galina Filho, au Dr Monica Montero Lomeli et au Dr Claudio Masuda pour le soutien apporté aux installations de laboratoire, ainsi qu’au Dr Martha Sorenson pour leurs commentaires aimables et précieux dans l’amélioration de l’article.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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