Högupplöst respirometri kopplad till fluorescenssensorer bestämmer mitokondriell syreförbrukning och generering av reaktiva syrearter (ROS). Det nuvarande protokollet beskriver en teknik för att bedöma mitokondriella andningsfrekvenser och ROS-produktion i den permeabiliserade ischiasnerven.
Mitokondriell dysfunktion i perifera nerver åtföljer flera sjukdomar associerade med perifer neuropati, som kan utlösas av flera orsaker, inklusive autoimmuna sjukdomar, diabetes, infektioner, ärftliga störningar och tumörer. Att bedöma mitokondriell funktion i musperifera nerver kan vara utmanande på grund av den lilla provstorleken, ett begränsat antal mitokondrier som finns i vävnaden och närvaron av en myelinmantel. Tekniken som beskrivs i detta arbete minimerar dessa utmaningar genom att använda ett unikt permeabiliseringsprotokoll anpassat från ett som används för muskelfibrer, för att bedöma ischiasnervens mitokondriella funktion istället för att isolera mitokondrierna från vävnaden. Genom att mäta fluorimetrisk reaktiv artproduktion med Amplex Red/Peroxidas och jämföra olika mitokondriella substrat och hämmare i saponinpermeabiliserade nerver var det möjligt att detektera mitokondriella andningstillstånd, reaktiva syrearter (ROS) och aktiviteten hos mitokondriella komplex samtidigt. Därför erbjuder metoden som presenteras här fördelar jämfört med bedömningen av mitokondriell funktion med andra tekniker.
Mitokondrier är viktiga för att upprätthålla cellviabilitet och utföra många cellfunktioner såsom energimetabolism (glukos, aminosyra, lipid och nukleotidmetabolismvägar). Som den primära platsen för produktion av reaktiva syrearter (ROS) är mitokondrier centrala i flera cellsignaleringsprocesser såsom apoptos och deltar i syntesen av järn-svavel (Fe-S) kluster, mitokondriell proteinimport och mognad och underhåll av deras genom och ribosomer 1,2,3. Mitokondriella membrandynamiknätverket styrs av fusions- och fissionsprocesser, och de har också maskiner för kvalitetskontroll och mitophagy 4,5,6.
Mitokondriell dysfunktion är förknippad med uppkomsten av flera patologiska tillstånd som cancer, diabetes och fetma7. Störningar i mitokondriell funktion detekteras vid neurodegenerativa störningar som påverkar centrala nervsystemet, som vid Alzheimers sjukdom 8,9, Parkinsons sjukdom10,11, amyotrofisk lateralskleros12,13 och Huntingtons sjukdom14,15 . I det perifera nervsystemet observeras förlust av mitokondriell funktion i axoner i immunneuropati, såsom Guillain-Barré syndrom16,17, och i samband med hög mitokondriell ROS-produktion i axoner leder dessa händelser till MAP Kinase-aktivering i Schwann-celler18. Detta visar att mitokondriell fysiologi kan vara avgörande inte bara för en platsspecifik cell utan för en hel vävnad. I HIV-associerad distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en roll i mekanismen genom vilken transaktivatorn för transkriptionsprotein (HIV-TAT) tillåter HIV att replikera effektivt, liksom flera andra roller i HIV-infektionspatogenes19,20.
Utvärdering av mitokondriell fysiologi i ischiasnerven har framstått som ett viktigt mål för att undersöka neuropati 7,21,22. Vid diabetisk neuropati tyder proteomiska och metabolomiska analyser på att de flesta molekylära förändringar vid diabetes påverkar mitokondriell oxidativ fosforylering och lipidmetabolism7. Dessa förändringar verkar också vara tidiga tecken på fetma-inducerad diabetes21. I en musmodell av kemoterapiinducerad smärtsam neuropati detekteras mitokondriell försämring i ischiasnerven som en minskning av oxidativ fosforylering22 och en minskning av mitokondriella komplexaktiviteter, membranpotential och ATP-innehåll23. Men även om flera grupper har citerat mitokondriell dysfunktion i neuropatier, är dessa studier begränsade till mätningar av aktivitet i mitokondriella komplex utan bevarande av mitokondriella membran, utan utvärdering av mitokondriell integritet eller mätningar av ATP-innehåll som en parameter för mitokondriell ATP-produktion. I allmänhet kräver en korrekt bedömning av mitokondriell syreförbrukning och ROS-produktion isolering av mitokondrier genom differentiell centrifugering i en percoll / sackarosgradient. Isolering av mitokondrier kan också vara en begränsande faktor för ischiasnervvävnad på grund av den stora mängd vävnad som behövs och mitokondriförlust och störningar.
Den aktuella studien syftar till att tillhandahålla ett protokoll för att mäta mitokondriell fysiologi som mitokondriell syreförbrukning och ROS-produktion i ischiasnerven, bevara mitokondriella membran och utan behov av isolerande mitokondrier. Detta protokoll är anpassat från syreförbrukningsmätningar i permeabiliserade muskelfibrer24 med högupplöst respirometri (HRR). Fördelarna med denna procedur är möjligheten att utvärdera mitokondrier i små mängder vävnad såsom ischiasnerven och utvärdera mitokondriella parametrar in situ och därigenom bevara mitokondriell miljö, struktur och bioenergetisk profil för att erhålla ett fysiologiskt tillförlitligt resultat. De mitokondriella andningstillstånden bestämdes med substrat och hämmare efter ischiasnervpermeabilisering för att korrekt bedöma mitokondriell bioenergetik och cytokrom c-koefficient för mitokondriell membranintegritet, vilket ger en guide för steg i mitokondriell elektrontransportsystem (ETS) utvärdering och beräkning av väsentliga parametrar. Denna studie kan ge verktyg för att svara på frågor i patofysiologiska mekanismer där ischiasnervmetabolism är inblandad, såsom perifera neuropatier.
Flera sjukdomar eller tillstånd som åtföljer neuropatier har mitokondriell dysfunktion som en riskfaktor. Utvärderingen av mitokondriell funktion i perifera nerver är avgörande för att belysa hur mitokondrierna verkar vid dessa neurodegenerativa tillstånd. Bedömningen av mitokondriell funktion är mödosam på grund av svårigheten med isoleringsmetoden och bristen på material. Således är utvecklingen av vävnadspermeabiliseringstekniker som inte kräver isolering av mitokondrier väsentlig.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansierades av Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi är tacksamma mot Dr Antonio Galina Filho, Dr Monica Montero Lomeli och Dr. Claudio Masuda för stödet med laboratoriefaciliteter och Dr. Martha Sorenson för vänliga och värdefulla kommentarer för att förbättra artikeln.
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |