Bedömning av mitokondriell funktion i ischiasnerven med högupplöst respirometri
Summary
Högupplöst respirometri kopplad till fluorescenssensorer bestämmer mitokondriell syreförbrukning och generering av reaktiva syrearter (ROS). Det nuvarande protokollet beskriver en teknik för att bedöma mitokondriella andningsfrekvenser och ROS-produktion i den permeabiliserade ischiasnerven.
Abstract
Mitokondriell dysfunktion i perifera nerver åtföljer flera sjukdomar associerade med perifer neuropati, som kan utlösas av flera orsaker, inklusive autoimmuna sjukdomar, diabetes, infektioner, ärftliga störningar och tumörer. Att bedöma mitokondriell funktion i musperifera nerver kan vara utmanande på grund av den lilla provstorleken, ett begränsat antal mitokondrier som finns i vävnaden och närvaron av en myelinmantel. Tekniken som beskrivs i detta arbete minimerar dessa utmaningar genom att använda ett unikt permeabiliseringsprotokoll anpassat från ett som används för muskelfibrer, för att bedöma ischiasnervens mitokondriella funktion istället för att isolera mitokondrierna från vävnaden. Genom att mäta fluorimetrisk reaktiv artproduktion med Amplex Red/Peroxidas och jämföra olika mitokondriella substrat och hämmare i saponinpermeabiliserade nerver var det möjligt att detektera mitokondriella andningstillstånd, reaktiva syrearter (ROS) och aktiviteten hos mitokondriella komplex samtidigt. Därför erbjuder metoden som presenteras här fördelar jämfört med bedömningen av mitokondriell funktion med andra tekniker.
Introduction
Mitokondrier är viktiga för att upprätthålla cellviabilitet och utföra många cellfunktioner såsom energimetabolism (glukos, aminosyra, lipid och nukleotidmetabolismvägar). Som den primära platsen för produktion av reaktiva syrearter (ROS) är mitokondrier centrala i flera cellsignaleringsprocesser såsom apoptos och deltar i syntesen av järn-svavel (Fe-S) kluster, mitokondriell proteinimport och mognad och underhåll av deras genom och ribosomer 1,2,3. Mitokondriella membrandynamiknätverket styrs av fusions- och fissionsprocesser, och de har också maskiner för kvalitetskontroll och mitophagy 4,5,6.
Mitokondriell dysfunktion är förknippad med uppkomsten av flera patologiska tillstånd som cancer, diabetes och fetma7. Störningar i mitokondriell funktion detekteras vid neurodegenerativa störningar som påverkar centrala nervsystemet, som vid Alzheimers sjukdom 8,9, Parkinsons sjukdom10,11, amyotrofisk lateralskleros12,13 och Huntingtons sjukdom14,15 . I det perifera nervsystemet observeras förlust av mitokondriell funktion i axoner i immunneuropati, såsom Guillain-Barré syndrom16,17, och i samband med hög mitokondriell ROS-produktion i axoner leder dessa händelser till MAP Kinase-aktivering i Schwann-celler18. Detta visar att mitokondriell fysiologi kan vara avgörande inte bara för en platsspecifik cell utan för en hel vävnad. I HIV-associerad distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en roll i mekanismen genom vilken transaktivatorn för transkriptionsprotein (HIV-TAT) tillåter HIV att replikera effektivt, liksom flera andra roller i HIV-infektionspatogenes19,20.
Utvärdering av mitokondriell fysiologi i ischiasnerven har framstått som ett viktigt mål för att undersöka neuropati 7,21,22. Vid diabetisk neuropati tyder proteomiska och metabolomiska analyser på att de flesta molekylära förändringar vid diabetes påverkar mitokondriell oxidativ fosforylering och lipidmetabolism7. Dessa förändringar verkar också vara tidiga tecken på fetma-inducerad diabetes21. I en musmodell av kemoterapiinducerad smärtsam neuropati detekteras mitokondriell försämring i ischiasnerven som en minskning av oxidativ fosforylering22 och en minskning av mitokondriella komplexaktiviteter, membranpotential och ATP-innehåll23. Men även om flera grupper har citerat mitokondriell dysfunktion i neuropatier, är dessa studier begränsade till mätningar av aktivitet i mitokondriella komplex utan bevarande av mitokondriella membran, utan utvärdering av mitokondriell integritet eller mätningar av ATP-innehåll som en parameter för mitokondriell ATP-produktion. I allmänhet kräver en korrekt bedömning av mitokondriell syreförbrukning och ROS-produktion isolering av mitokondrier genom differentiell centrifugering i en percoll / sackarosgradient. Isolering av mitokondrier kan också vara en begränsande faktor för ischiasnervvävnad på grund av den stora mängd vävnad som behövs och mitokondriförlust och störningar.
Den aktuella studien syftar till att tillhandahålla ett protokoll för att mäta mitokondriell fysiologi som mitokondriell syreförbrukning och ROS-produktion i ischiasnerven, bevara mitokondriella membran och utan behov av isolerande mitokondrier. Detta protokoll är anpassat från syreförbrukningsmätningar i permeabiliserade muskelfibrer24 med högupplöst respirometri (HRR). Fördelarna med denna procedur är möjligheten att utvärdera mitokondrier i små mängder vävnad såsom ischiasnerven och utvärdera mitokondriella parametrar in situ och därigenom bevara mitokondriell miljö, struktur och bioenergetisk profil för att erhålla ett fysiologiskt tillförlitligt resultat. De mitokondriella andningstillstånden bestämdes med substrat och hämmare efter ischiasnervpermeabilisering för att korrekt bedöma mitokondriell bioenergetik och cytokrom c-koefficient för mitokondriell membranintegritet, vilket ger en guide för steg i mitokondriell elektrontransportsystem (ETS) utvärdering och beräkning av väsentliga parametrar. Denna studie kan ge verktyg för att svara på frågor i patofysiologiska mekanismer där ischiasnervmetabolism är inblandad, såsom perifera neuropatier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera sjukdomar eller tillstånd som åtföljer neuropatier har mitokondriell dysfunktion som en riskfaktor. Utvärderingen av mitokondriell funktion i perifera nerver är avgörande för att belysa hur mitokondrierna verkar vid dessa neurodegenerativa tillstånd. Bedömningen av mitokondriell funktion är mödosam på grund av svårigheten med isoleringsmetoden och bristen på material. Således är utvecklingen av vävnadspermeabiliseringstekniker som inte kräver isolering av mitokondrier väsentlig.
<p class="jov…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades av Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi är tacksamma mot Dr Antonio Galina Filho, Dr Monica Montero Lomeli och Dr. Claudio Masuda för stödet med laboratoriefaciliteter och Dr. Martha Sorenson för vänliga och värdefulla kommentarer för att förbättra artikeln.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referências
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genética. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
