माइक्रोआरएनए क्लस्टर नेटवर्क विश्लेषण के लिए सीआरआईएसपीआर जीन संपादन उपकरण
Summary
यह प्रोटोकॉल माइक्रोआरएनए क्लस्टर नेटवर्क विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) जीन संपादन वर्कफ़्लो का वर्णन करता है जो आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों के एक पैनल की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देता है जो अद्वितीय एमआईआरएनए क्लस्टर सदस्य विलोपन संयोजनों को एक प्रयोग के भीतर 35 केबी जितना बड़ा होता है।
Abstract
माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) कैंसर और मेटास्टेसिस के महत्वपूर्ण सेलुलर नियामकों (ट्यूमर सप्रेसर, प्रो-ऑन्कोजेनिक कारक) के रूप में उभरे हैं। अधिकांश प्रकाशित अध्ययन कैंसर में छोटे आरएनए की भूमिका की विशेषता के दौरान एक एकल एमआईआरएनए पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, मानव एमआईआरएनए जीन का ~ 30% क्लस्टर इकाइयों में व्यवस्थित किया जाता है जो अक्सर सह-व्यक्त होते हैं, जो नॉनकोडिंग आरएनए विनियमन की एक जटिल और समन्वित प्रणाली का संकेत देते हैं। क्लिनिक में नॉनकोडिंग छोटे आरएनए का अनुवाद करने से पहले ट्यूमर के विकास, कैंसर की आक्रामकता और दवा प्रतिरोध को विनियमित करने के लिए क्लस्टर एमआईआरएनए नेटवर्क सहकारी रूप से कैसे कार्य करते हैं, इसका एक स्पष्ट अंडरटेलिंग आवश्यक है।
प्रोस्टेट कैंसर के संदर्भ में ~ 35,000 बीपी लंबाई में फैले स्थान के भीतर स्थित सात एमआईआरएनए जीन के जीनोमिक क्लस्टर की ऑन्कोजेनिक भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) -मध्यस्थता जीन संपादन प्रक्रिया का उपयोग नियोजित किया गया है। इस दृष्टिकोण के लिए, मानव कैंसर सेल लाइनों को 48 घंटे के लिए डॉक्स युक्त माध्यम में उगाए गए डॉक्सीसाइक्लिन (डॉक्स) -इंड्यूसिबल कैस 9 न्यूक्लियस के लिए एक लेंटीवायरस वेक्टर से संक्रमित किया गया था। कोशिकाओं को बाद में सिंथेटिक ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआईएसपीआर आरएनए (टीआरएसआरएनए) के साथ सह-संक्रमित किया गया था, जो जीनोमिक साइट-विशिष्ट सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ जटिल था ताकि कैंसर सेल लाइनों की तेजी से पीढ़ी को एक ही प्रयोग के भीतर पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन और व्यक्तिगत या संयोजन एमआईआरएनए जीन क्लस्टर विलोपन की अनुमति मिल सके।
इस उच्च थ्रूपुट जीन संपादन प्रणाली के फायदे समय लेने वाली डीएनए वेक्टर सबक्लोनिंग से बचने की क्षमता, 24-अच्छी तरह से प्रारूप में अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों के साथ ट्रांसफेक्टिंग कोशिकाओं में लचीलापन, और क्रूड सेल लाइसेट्स का उपयोग करके कम लागत वाले पीसीआर जीनोटाइपिंग हैं। इस सुव्यवस्थित दृष्टिकोण का उपयोग करने वाले अध्ययन एमआईआरएनए क्लस्टर सदस्यों के बीच कार्यात्मक अतिरेक और सहक्रियात्मक / विरोधी बातचीत को उजागर करने का वादा करते हैं, जो मानव रोग में शामिल जटिल छोटे नॉनकोडिंग आरएनए नेटवर्क को चिह्नित करने में सहायता करेगा और भविष्य के चिकित्सीय डिजाइन को बेहतर ढंग से सूचित करेगा।
Introduction
मानव रोग में नॉनकोडिंग आरएनए के योगदान की जांच के लिए बेहतर शोध उपकरणों की आवश्यकता है। एमआईआरएनए डिसरेगुलेशन अक्सर कैंसर जैसे मानव विकारों में देखा जाता है जब कैंसर रोगियों के ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थों (जैसे, रक्त, मूत्र) में इन छोटे नॉनकोडिंग आरएनए की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना गैर-कैंसर, स्वस्थ व्यक्ति, माइक्रोएरे, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर), और अगली पीढ़ी की गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को नियोजित करते हैं 1,2 . हाल के काम ने इन एमआईआरएनए के एक बड़े सबसेट को ट्यूमर सप्रेसर, ऑन्कोजेनिक और मेटास्टेसिस कारकों के रूप में चिह्नित किया है जो ट्यूमर के गठन, रोग प्रगति और दवा प्रतिरोध को नियंत्रित करते हैं। एमआईआरएनए के प्रायोगिक ओवरएक्सप्रेशन और / या डाउनरेगुलेशन / हानि के परिणामस्वरूप कोशिका में कार्यात्मक और प्लियोट्रोपिक परिणाम होते हैं, जो कैंसर से जुड़ी गतिविधियों की विस्तृत श्रृंखला को दर्शाते हैं, ये नॉनकोडिंग आरएनए समन्वय करते हैं – विकास, एपोप्टोसिस, भेदभाव, क्रोमेटिन रीमॉडेलिंग, एंजियोजेनेसिस, मेसेनकाइमल (ईएमटी) और एमईटी संक्रमण, चयापचय और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए उपकला3.
एमआईआरएनए को एकल जीन के रूप में एन्कोड किया जाता है या जीनोमिक क्लस्टर में रहते हैं, जो नाभिक में स्थानांतरित होते हैं और साइटोप्लाज्म4 में स्थानीयकृत जैविक रूप से परिपक्व, एकल-फंसे ~ 22 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) एमआईआरएनए प्रजातियों को उत्पन्न करने से पहले बड़े पैमाने पर संसाधित होते हैं। ये छोटे आरएनए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से अपने प्रभाव डालते हैं और नकारात्मक जीन नियामकों के रूप में कार्य करते हैं जो उत्प्रेरक आरएनए-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (आरआईएससी) को एमआरएनए साइट पर लाने के लिए अनुक्रम-विशिष्ट तरीके से मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) लक्ष्यों को बांधते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एमआरएनए गिरावट और / एमआईआरएनए पशु प्रणालियों में नॉनकोडिंग आरएनए का एक अत्यंत प्रचुर मात्रा में वर्ग है, और मानव जीनोम में 2,654 परिपक्व एमआईआरएनए मौजूद हैं (एमआईआरबेस रिलीज 22.1)5। एमआईआरएनए आमतौर पर अपने एमआरएनए लक्ष्यों के लिए अपूर्ण पूरकता के साथ संबद्धहोते हैं 4. इसलिए, एक एकल एमआईआरएनए दसियों से सैकड़ों अलग-अलग एमआरएनए लक्ष्यों को विनियमित कर सकता है और कार्यात्मक रूप से जैविक मार्गों की एक बड़ी श्रृंखला को प्रभावित कर सकता है। एमआईआरएनए-आधारित तंत्र की जटिलता को जोड़ने के लिए, एक एकल एमआरएनए को कई, अलग-अलग एमआईआरएनए द्वारा विनियमित किया जा सकता है। इस प्रकार, यह जांचना चुनौतीपूर्ण है कि कैसे एमआईआरएनए डिसरेगुलेशन शरीर के होमियोस्टैटिक संतुलन को बाधित करता है और मानव दुर्दमता की ओर जाता है।
अधिकांश प्रकाशित अध्ययनों ने बीमारी की घटनाओं में उनकी भूमिका की विशेषता के दौरान एक एकल एमआईआरएनए पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, मानव एमआईआरएनए जीन का ~ 30% क्लस्टर इकाइयों (आमतौर पर ~ 10 किलोबेस [केबी]) में व्यवस्थित किया जाता है जो अक्सर एक ही अभिविन्यास और सह-व्यक्त में प्रतिलेखित होते हैं, जो नॉनकोडिंग आरएनए विनियमन 6 की एक समन्वित और जटिल प्रणाली का संकेतदेते हैं। सबसे बड़ा पॉलीसिस्ट्रोनिक मानव एमआईआरएनए क्लस्टर 14q32 क्लस्टर है जिसमें 54 एमआईआरएनए अग्रदूत शामिल हैं। मानव कैंसर से जुड़ी सबसे अच्छी तरह से अध्ययन की गई क्लस्टर एमआईआरएनए इकाइयों में से एक एमआईआर -17-92 पॉलीसिस्ट्रोनिक क्लस्टर है जिसमें एमआईआर -17, एमआईआर -18 ए, एमआईआर -19 ए, एमआईआर -20 ए, एमआईआर -19 बी -1, और एमआईआर -92-1 शामिल हैं, जो नॉनकोडिंग आरएनए, सी 13 ओआरएफ 25 के इंट्रॉन 3 के भीतर रहते हैं। एमआईआर -17-92 क्लस्टर को अक्सर हेमटोपोइएटिक दुर्दमताओं में प्रवर्धित किया जाता है और ठोस ट्यूमर में अतिरंजित किया जाता है और सेल चक्र प्रगति, एपोप्टोसिस और एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने में ऑन्कोजेनिक भूमिकाएं स्थापितकी हैं। इसके अलावा, नॉनकोडिंग जीन ल्यू 2 के इंट्रॉन के भीतर स्थित ट्यूमर दमनकारी एमआईआर -15 ए और एमआईआर -16-1 क्लस्टर को अक्सर ल्यूकेमिया में हटा दिया जाता है और कैंसर की एक बड़ी श्रृंखला में डाउनरेगुलेट किया जाता है, जो एंटीएपोप्टोटिक जीन बीसीएल 2 और अतिरिक्त सेल चक्र प्रगति जीन 8 को लक्षित करके ट्यूमर के विकास को अवरुद्ध करनेके लिए कार्य करता है। एमआईआर -888 क्लस्टर उच्च ग्रेड प्रोस्टेट कैंसर वाले रोगियों में ऊंचा है और इसमें मानव गुणसूत्र एक्सक्यू 27.3 9,10 पर स्थित सात एमआईआरएनए जीन (एमआईआर -892 सी, -890, -888, -892 ए, -892 बी, -891 बी और –891 ए) शामिल हैं।
एचपीसीएक्स 1 लोकस (वंशानुगत प्रोस्टेट कैंसर, एक्स-लिंक्ड 1) के भीतर एमआईआर -888 क्लस्टर मानचित्र एक्सक्यू 27-2 में फैले हुए हैं, जिसे वंशानुगत प्रोस्टेट कैंसर परिवार वंशावली 11,12,13,14,15,29 के लिंकेज विश्लेषण द्वारा पहचाना गया था। पारंपरिक एमआईआरएनए मिसएक्सप्रेशन टूल – एमआईआरएनए मिमिक्स और एंटीसेंस इनहिबिटर का उपयोग करके व्यक्तिगत एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन ने संकेत दिया कि ये एमआईआरएनए प्रोस्टेट ट्यूमर के विकास और आक्रमण 9,10 को विनियमित करने में अतिव्यापी भूमिका निभाते हैं। हालांकि, ये प्रयोगात्मक तरीके खुद को यह अध्ययन करने के लिए आसानी से उधार नहीं देते हैं कि ऊतक होमियोस्टेसिस और कैंसर की प्रगति को नियंत्रित करने के लिए कई एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्य एक नॉनकोडिंग आरएनए नेटवर्क में सहक्रियात्मक या विरोधी रूप से कैसे कार्य करते हैं। उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर जीन संपादन तकनीक का उपयोग करके इस वर्णित सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल को इस ज्ञान अंतर को पाटने के लिए मानव कैंसर (जैसे, एमआईआर -888 क्लस्टर) से जुड़े एमआईआरएनए क्लस्टर को आणविक रूप से विच्छेदन करने के लिए संशोधित किया गया है।
बैक्टीरियल सीआरआईएसपीआर और सीआरआईएसपीआर से जुड़े (सीएएस) जीन बैक्टीरियोफेज के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा की मध्यस्थता करते हैं16. इस प्राचीन प्रोकैरियोटिक निगरानी प्रणाली की खोज को किसी भी वांछित जीनोमिक लोकस को आसानी से लक्षित करने और इन विट्रो और विवो16,17 दोनों में पशु प्रणालियों और सेल प्रकारों की एक बड़ी श्रृंखला के भीतर डीएनए अनुक्रम परिवर्तन करने के लिए एक कुशल वैज्ञानिक उपकरण के रूप में जल्दी से अनुकूलित किया गया था। यह तकनीक मानव रोग के संदर्भ में एमआईआरएनए नेटवर्क से पूछताछ करने के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में महान वादा करती है। यह अंत करने के लिए, अमर मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों (एलएनसीएपी, पीसी 3-एमएल) में मानव गुणसूत्र एक्स पर ~ 35 केबी फैले एमआईआर -888 क्लस्टर का अध्ययन करने के लिए यह उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रोटोकॉल का निर्माण यह पूछताछ करने के लिए किया जाता है कि क्लस्टर सदस्य कैंसर प्रगति मार्गों का समन्वय कैसे करते हैं। इस दृष्टिकोण को किसी भी एमआईआरएनए क्लस्टर की विशेषता के लिए लागू किया जा सकता है और जांचकर्ताओं को एक ही प्रयोग के भीतर पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन और व्यक्तिगत और संयोजन एमआईआरएनए जीन क्लस्टर विलोपन को ले जाने वाली मानव सेल लाइनों को तेजी से उत्पन्न करने की अनुमति देता है।
इस प्रक्रिया में, स्थिर सेल लाइनों को एक डॉक्सीसाइक्लिन (डॉक्स) -इंड्यूसिबल लेंटिवायरल अभिव्यक्ति प्रणाली ले जाने में स्थापित किया जाता है जो अन्वेषक को संवैधानिक डॉक्स-इंड्यूसिबल प्रमोटर टीआरई 3 जी के माध्यम से स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस सीआरआईएसपीआर-जुड़े एंडोन्यूक्लाइज कैस 9 (सीएसएन 1) जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में सक्षम बनाता है। टेट-ऑन 3 जी द्विदलीय प्रणाली में टेट-ऑन 3 जी जीन और ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोध जीन (ब्लास्टआर) दोनों के प्रतिलेखन को द्विसिस्ट्रोनिक प्रतिलेख के रूप में चलाने के लिए एक संवैधानिक मानव बढ़ाव कारक 1 अल्फा (एचईएफ 1 अल्फा) प्रमोटर शामिल है। टेट-ऑन 3 जी ट्रांसएक्टिवेटर प्रोटीन केवल डॉक्स की उपस्थिति में टीआरई 3 जी प्रमोटर को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप मजबूत कैस 9 प्रतिलेखन होता है। डॉक्स की अनुपस्थिति में, कोई या बहुत कम बेसल कैस 9 अभिव्यक्ति नहीं है। इसलिए, अन्वेषक सीआरआईएसपीआर जीन संपादन चरणों के दौरान डॉक्स के साथ पूरक मीडिया में उगाई गई कोशिकाओं में उच्च कैस 9 प्रोटीन उत्पादन को प्रेरित कर सकता है और डॉक्स निकासी पर तेजी से सीएएस 9 प्रोटीन निकासी के लिए नियंत्रण कर सकता है।
यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के डिजाइन का भी वर्णन करता है जो क्लस्टर के भीतर पूरे एमआईआरएनए क्लस्टर, व्यक्तिगत एमआईआरएनए हेयरपिन (प्रीमिरना) क्षेत्रों और / प्रत्येक डिज़ाइन किए गए सीआरआरएनए में एक अद्वितीय 5′-टर्मिनल 20 एनटी गाइड अनुक्रम (लक्षित होने के लिए ब्याज के जीनोमिक अनुक्रम के पूरक) होता है, इसके बाद एक अपरिवर्तनीय 22 एनटी एस पायोजेनेस रिपीट सीक्वेंस (5′-एक्स -3 ‘)होता है जो सार्वभौमिक ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआईएसपीआर आरएनए (ट्रैक) के साथ बेस-पेयरिंग को सक्षम बनाता है। साथ में, एनील्ड सीआरआरएनए और ट्रैकआरएनए (मिश्रित 1: 1 अनुपात) इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए) के लिए गाइड आरएनए के रूप में कार्य करते हैं। प्रत्येक प्रयोग में, दो सिंथेटिक गाइड आरएनए को डॉक्स-प्रेरित कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है ताकि बैक्टीरिया कैस 9 प्रोटीन को जीनोमिक डीएनए साइटों (5 ‘और 3’) को हटाने के लिए लक्षित एमआईआरएनए क्लस्टर क्षेत्र (चित्रा 1 बी) को जोड़ा और एस्कॉर्ट किया जा सके।
एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम (जंगली प्रकार एस पायोजेनेस कैस 9 के लिए 5′-एनजीजी -3′) सेल जीनोम में मौजूद होना चाहिए और गाइड आरएनए17 द्वारा लक्षित 20 एनटी डीएनए अनुक्रम के तुरंत निकट स्थित होना चाहिए। पीएएम अनुक्रम एक बाध्यकारी संकेत के रूप में कार्य करता है और लक्षित जीनोमिक डीएनए साइट पर एंडोन्यूक्लाइज कैस 9 एंजाइम के उत्प्रेरक क्षेत्र को स्थित करता है, बाद में पीएएम के ~ 3 एनटी अपस्ट्रीम स्थित निर्देशित, डबल-फंसे (डीएस) डीएनए दरार की ओर जाता है। सेल की डीएनए मरम्मत मशीनरी क्लीव्ड डीएनए सिरों की मरम्मत करती है, जिसके परिणामस्वरूप सही बंधाव हो सकता है, लेकिन अक्सर नॉनहोमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) होता है, जिससे मरम्मत स्थल पर छोटे सम्मिलन या विलोपन (इंडेल) होते हैं। चूंकि एमआईआरएनए नॉनकोडिंग जीन हैं जो अक्सर इंटरजेनिक और इंट्रोनिक क्षेत्रों के भीतर स्थित होते हैं, इसलिए इन इंडेल में अवांछित बकवास /
इन प्रयोगों में गाइड आरएनए कॉम्प्लेक्स के लिए सिंथेटिक आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एनील्ड सीआरआरएनए और ट्रैकआरएनए, 1: 1 दाढ़ अनुपात) एन्कोडिंग को नियोजित करके, यह जीन नॉकआउट रणनीति समय लेने वाली डीएनए वेक्टर सबक्लोनिंग से बचती है और 24-अच्छी तरह से प्रारूप में कोशिकाओं को अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों को ट्रांसफेक्ट करने में भारी लचीलेपन की अनुमति देती है। पीसीआर जीनोटाइप स्क्रीनिंग के लिए क्रूड सेल लाइसेट्स की तैयारी भी महंगी और समय लेने वाली डीएनए शुद्धि विधियों से बचती है, जबकि सुव्यवस्थित एकल कॉलोनी सेल लाइन पीढ़ी और फेनोटाइपिक विश्लेषण की अनुमति देती है। दरअसल, इस उच्च थ्रूपुट सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रोटोकॉल का उपयोग एक ही प्रयोग में 32 अद्वितीय गाइड आरएनए संयोजनों के साथ सुसंस्कृत प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों (एलएनसीएपी, पीसी 3-एमएल) को ट्रांसफेक्ट करने और पूरे ~ 35 केबी एमआईआर -888 क्लस्टर क्षेत्र के लिए विलोपन ले जाने वाली नॉकआउट लाइनों को उत्पन्न करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है; एमआईआर -743 और एमआईआर -891 ए परिवारों से संबंधित एमआईआर -888 क्लस्टर सदस्यों के लिए छोटे विलोपन संयोजन; साथ ही एमआईआर -888 क्लस्टर के भीतर व्यक्तिगत एमआईआरएनए सदस्यों के लिए विलोपन। इस तरह के अध्ययन एक स्पष्ट समझ प्रदान करेंगे कि चिकित्सीय और नैदानिक उपकरण के रूप में क्लिनिक में एमआईआरएनए का अनुवाद करने से पहले ट्यूमर के विकास, आक्रामकता और दवा प्रतिरोध को विनियमित करने के लिए क्लस्टर एमआईआरएनए सहकारी रूप से कैसे कार्य करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह सीआरआईएसपीआर जीन संपादन प्रक्रिया अन्वेषक को अद्वितीय एमआईआरएनए क्लस्टर विलोपन संयोजनों को ले जाने वाली सेल लाइनों के पूरे पैनल को जल्दी से उत्पन्न करने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में सिंथे?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पीसी 3-एमएल सेल लाइनों को मार्क स्टीयरन (ड्रेक्सल यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन) द्वारा प्रदान किया गया था। जस्टिन टोक्सी ने पीसीआर जीनोटाइपिंग में सहायता की। इस काम को ब्रीडन एडम्स फाउंडेशन ग्रांट, एक रयान ट्रांसलेशनल रिसर्च फंड और एई-के के लिए एक राष्ट्रमंडल स्वास्थ्य अनुसंधान बोर्ड अनुदान (सीएचआरबी -274-11-20) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.2 mL PCR tubes, flat cap | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| 24-well tissue culture plate | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagent, genotyping |
| 6-well tissue culture plate | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal | AbCam | ab191468 | Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200 |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue culture reagent |
| BLAST nucleotide search engine | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; Cell counter |
| Cryogenic tubes | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231100 | Tisuue culture reagent |
| DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10013CV | Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells |
| Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | Tisuue culture reagent |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol |
Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides |
| EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences. |
| GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500 |
| Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit | IBI Scientific | IB47010 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000044 | Tisuue culture reagent |
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | MilliporeSigma | IPFL10100 | Western blot reagent; nitrocellulose |
| Intercept (TBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-60001 | Western blot reagent |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | Western blot reagent |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | Western blot reagent |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb. |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot reagent |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | Equipment; Western blot imaging |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Transfection reagent |
| Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System | Owl | D2-BP | Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system |
| PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) | Integrated DNA Technology | NA | PCR reagent, genotyping |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Scientific | F530S | PCR reagent, genotyping |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot reagent |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Invitrogen | 25530049 | PCR reagent, genotyping |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR reagent, genotyping |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | MT10041CV | Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12563029 | Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipment |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | Equipment; Protein gel electrophoresis system |
Referências
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